膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的原發性惡性腦腫瘤，約占所有原發性惡性腦腫瘤的80%，且預后不佳，生活質量差，中位生存期< 1年。GBM的標準治療是手術切除，伴隨放療和替莫唑胺化療。雖然由于基因治療、免疫治療、疫苗治療等的發展，多種治療方法有所改善，管理GBM復發的治療選擇依然有限。大多數基于免疫檢查抑制點的GBM臨床研究和疫苗療法的試驗都沒有成功。通過免疫治療GBM臨床試驗失敗的原因歸因于幾個因素，包括高度免疫抑制環境和多種治療耐藥機制。GBM誘導局部免疫功能障礙和全身免疫抑制，從而引起GBM與周圍腫瘤微環境之間更復雜的偶聯關系。腫瘤微環境是局部免疫功能紊亂的至關重要的因素之一，它為癌細胞、多種基質細胞和細胞外成分建立了小生境。腫瘤微環境在特定條件的建立中起著關鍵性作用，從而干擾血管生成、細胞死亡、氧化應激和免疫逃逸。越來越多的研究揭示，腫瘤微環境不僅在腫瘤的發生、進展和遷移中至關重要，而且還影響治療耐藥性和惡性腫瘤的產生。腫瘤微環境的細胞組成和免疫細胞的可及性在GBM亞型和患者中表現出較大的變異。這些因素導致GBM的免疫抑制，進而導致免疫治療失敗。鑒定與腫瘤微環境相關的積極參與類型的免疫基因和免疫細胞有助于闡明GBM免疫抑制的一般機制。近期，浙江大學醫學院附屬第一醫院神經外科潘劍威教授及其團隊調查了GBM中生存相關的免疫細胞，并確定了與免疫細胞浸潤相關的hub基因，相關研究以“Identification of Immune Cell Infiltration and Immune-Related Genes in the Tumor Microenvironment of Glioblastomas”為題發表在Front Immunol雜志上，雜志影響因子為5.085。 

技術路線：

結果：

1、生存相關免疫細胞的來源和鑒定

作者從TCGA數據庫下載166例GBM的公開數據，包括RNA-Seq和臨床數據，使用Kaplan-Meier生存分析免疫細胞豐度比之間的相關性，以闡明免疫細胞豐度比在總生存期中的潛在作用，生存分析結果表明M0巨噬細胞之間存在顯著負相關，而單核細胞、活化NK細胞和嗜酸性粒細胞可預測陽性總生存期（圖A-F）。         

2、與生存相關免疫細胞相關的臨床數據

為確定免疫細胞對GBM臨床特征的影響，作者下載相關GBM臨床數據，探討與生存相關免疫細胞豐度比值的相關性。臨床特征包括年齡、性別、表達亞類和MGMT啟動子狀態。單核細胞和嗜酸性粒細胞的比值比在神經型和神經前型中增加，男性高于女性。

3、免疫相關基因的篩選

作者將免疫相關基因分為GBM中的高表達組和低表達組，火山圖顯示了4種存活相關免疫細胞的獨特基因表達譜，在單核細胞中共鑒定出1107個基因，巨噬細胞M0中共鑒定出1137個基因，活化NK細胞中共鑒定出1742個基因，嗜酸性粒細胞中共鑒定出1336個基因（圖A-D），維恩圖呈現4種免疫細胞浸潤中表達的38個相同基因（圖E）。

4、免疫相關基因的功能富集分析

GO分析發現，免疫相關基因在神經系統發育、細胞粘附、細胞外基質組織和化學突觸傳遞的生物學過程中顯著富集（圖A），細胞組分中的基因主要富集在質膜、胞外外泌體、胞外間隙和胞外區（圖B），分子功能中的基因富集在蛋白結合、鈣結合、細胞骨架的結構組成和微管結合（圖C）；KEGG分析發現免疫相關基因與細胞粘附分子、cAMP信號通路、白細胞跨內皮遷移、蛋白消化吸收、Toll樣受體信號通路相關聯（圖D），這些結果證明基因與腫瘤微環境的細胞外基質和細胞相互作用有關。

5、基于PPI網絡的模塊化分析

考慮到PPI網絡在基因數量方面的局限性，作者篩選了所有差異表達基因，但選擇了至少兩個免疫細胞中共表達的基因。總的來說，作者從4122個基因中鑒定出920個基因。將這些基因導入在線STRING工具，闡明免疫相關基因的相互作用，最后得到了具有357個基因的PPI網絡，組合評分設定為≥0.4（圖A），并選擇了最重要的模塊進行進一步的功能分析（圖B）。

6、與生存相關的Hub基因的識別

根據臨界值標準，從PPI網絡中共鑒定出模塊中具有高連通性的24個hub基因，其中6個hub基因與生存率顯著相關，GRIA1、BST2、B2M、TRIM21與總生存期呈正相關，而GRIA2和MAP2與不良預后相關（圖A-F）。

使用Person相關性分析24個hub基因和22個免疫細胞之間的關系，在腫瘤免疫評估資源中驗證了免疫細胞類型的浸潤水平與生存相關hub基因之間的顯著關系，結果表明CD8+ T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平與GRIA1、GRIA2和MAP2顯著相關， BST2和B2M與B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞相關，TRIM21與B細胞和中性粒細胞相關(圖A-B)。

7、CGGA數據庫驗證免疫相關細胞，單細胞測序數據驗證免疫相關基因

作者從CGGA數據庫下載134例GBM樣本的免疫細胞基因表達數據，探討從TCGA數據庫中鑒定的免疫細胞的意義，結果顯示活化的NK細胞和單核細胞與陽性預后相關，這與之前從TCGA數據庫中獲得的數據一致。作者確定hub基因的預后價值后，分析了GBM中生存相關hub基因與免疫細胞浸潤的相關性，將細胞分為惡性和非惡性細胞類型，且高表達標記物分為巨噬細胞、T細胞、少突膠質細胞等非惡性細胞，A1F1、C3AR1、FCGR1A、MNDA、HMOX1、TLR2僅在巨噬細胞中表達，B2M、CCT3、HSPA8、TUBA1A在4種細胞簇中均有明顯表達。參照生存相關基因，在巨噬細胞、T細胞和惡性細胞中檢測到BST2；GRIA1和GRIA2在少突膠質細胞和惡性細胞中表達；MAP2僅在惡性細胞中檢測到；然而，在任何細胞類型中均未檢測到TRIM21。

結論：

腫瘤微環境中浸潤的免疫細胞和其他基質成分與GBM的預后相關，本研究發現了24個浸潤腫瘤微環境的免疫相關基因，可作為新的生物標志物和免疫治療靶點。

參考文獻：

Sicong Huang, Zijun Song, Tiesong Zhang, et al. Identification of Immune Cell Infiltration and Immune-Related Genes in the Tumor Microenvironment of Glioblastomas. Front Immunol. 2020.