研究背景

K-ras突變是驅(qū)動癌癥發(fā)展與侵襲性惡性表型相關(guān)的主要遺傳事件，而免疫檢查點分子PD-L1的表達(dá)在逃避免疫監(jiān)視的癌癥中起關(guān)鍵作用。K-ras致癌信號與PD-L1表達(dá)的關(guān)系是一個需要進一步研究的重要領(lǐng)域。文章利用K-ras驅(qū)動的腫瘤體外和體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ脱芯恐掳┑?/span>K-ras, PD-L1表達(dá)與氧化還原調(diào)節(jié)之間的關(guān)系。（Redox Biol, IF=9.986）

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

1.致癌k-ras的激活誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)

在小鼠和人胰腺癌組織中，k-ras驅(qū)動的胰腺癌組織中PD-L1的表達(dá)升高(Fig. 1A)。在T-Rex/K-ras細(xì)胞（強力霉素誘導(dǎo)的K-ras^G12V表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)）中檢測發(fā)現(xiàn)K-ras^G12V的激活導(dǎo)致PD-L1mRNA的表達(dá)時間依賴性升高，并持續(xù)保持高水平(Fig. 1B)。WB和流式進一步驗證(Fig. 1C和D),通過檢測其受體PD-1和另一亞基PD-L2，K-ras^G12V的激活導(dǎo)致PD-L1 mRNA的升高具有特異性(Fig. 1E)。

Figure 1

2. K-ras通過生長因子信號誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)

如圖2A，HEK293T與T-Rex/K-ras/On細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM）共培養(yǎng)導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)顯著升高，而T-Rex/K-ras/Off細(xì)胞(CM/Off)或強力霉素(Doxy)的CM均未誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)增加，研究顯示條件培養(yǎng)基中的分泌因子，被致癌K-ras調(diào)節(jié)從而刺激PD-L1表達(dá)。K-ras^G12V導(dǎo)致EGF, FGF1, IL-1α,EGFR, FGFR1, IL1R1A 表達(dá)升高(Fig. 2B)。K-ras^G12V/On 細(xì)胞中EGF, FGF1和IL-1α的分泌增加，EGFR 和FGFR1的表達(dá)升高(Fig. 2D)。EGF和FGF1刺激T-Rex/K-ras能夠誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)，但是IL-1α沒有改變(Fig. 2E–G)。

EGFR 抑制劑 (Gefitinib and Afatinib) and FGFR1抑制劑(PD173074)能夠抑制K-ras^G12V誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)(Fig. 3A)。Afatinib和PD173074的作用在48小時不顯著(Fig. 3B–C)。K-ras^G12V激活AKT(Fig. 3B). EGFR or FGFR抑制劑不能抑制PD-L1的表達(dá)。敲除AKT1抑制T-Rex/K-ras/On細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)(Fig. 3D)。強力霉素誘導(dǎo)的K-ras引起Akt磷酸化水平的持續(xù)升高(圖3B, D)，表明K-ras激活Akt。PI3K抑制劑LY294002和Akt抑制劑MK-2206進一步驗證AKT在K-ras^G12V誘導(dǎo)的PD-L1的表達(dá)中的作用(Fig. 3E–F)。體內(nèi)實驗中，PD173074（FGFR1抑制劑）能夠顯示減少Akt的活化和PD-L1的表達(dá)(Fig. 3G–H)。

Figure 2

Figure 3

3. 在胰腺癌細(xì)胞中，FGFR1在K-ras誘導(dǎo)的PS-L1表達(dá)中發(fā)揮重要作用

在HPNE/K-ras細(xì)胞中，PD-L1, EGFR and FGFR1 mRNA表達(dá)升高(Fig. 4A)，而EGF和FGF1在HPNE細(xì)胞系中的表達(dá)沒有變化(Fig. 4A)。WB顯示HPNE/K-ras細(xì)胞中，只有FGFR1蛋白顯著增加(圖4B)，提示FGFR1信號通路可能是介導(dǎo)PD-L1表達(dá)的主要途徑。在Panc-1和CFPAC-1細(xì)胞中，FGF和EGF也能調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，而在SW1990和Capan-2細(xì)胞中則無此作用。敲除FGFR1，PD-L1的表達(dá)降低(Fig. 4F–H)。證明了FGFR1在胰腺癌中調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)的重要作用，并且PD-L1表達(dá)與FGFR1表達(dá)呈正相關(guān)

Figure 4

4.ROS介導(dǎo)K-ras誘導(dǎo)的PD-L1的表達(dá)通過FGFR1通路的激活

K-ras^G12V/Off細(xì)胞經(jīng)H2O2處理，PD-L1表達(dá)顯著增加(Fig. 5A)；加GLOX （葡糖氧化酶）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS上調(diào)(Fig. 5B)。ROS壓力導(dǎo)致PD-L1上調(diào)(Fig. 5C-D)。抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)能將K-ras^G12V/On細(xì)胞內(nèi)ROS降低到與K-ras^G12V/Off細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?/span>(Fig. 5E)，并阻止K-ras^G12V誘導(dǎo)的PD-L1上調(diào)(Fig. 5F)。GLOX增加與PD-L1表達(dá)相關(guān)的FGFR1的蛋白表達(dá)(Fig. 5H)。如圖5I所示，GLOX產(chǎn)生的ROS僅能在FGFR1正常的K-ras^G12V/Off細(xì)胞中增加PD-L1的表達(dá)，但敲除FGFR1后，這種作用幾乎完全消失(圖5I)。四種人胰腺癌細(xì)胞暴露于不同濃度的H2O2 (氧化應(yīng)激)后，PDL1表達(dá)均有所增加，過氧化氫酶可以再次消除這種PD-L1的產(chǎn)生(圖5J)。在體外和體內(nèi)表達(dá)突變K-ras的小鼠胰腺癌模型中,抗氧化劑NAC降低了PD-L1的表達(dá)(圖S6I)

Figure 5

5.在免疫活性小鼠和免疫缺陷小鼠中，FGFR1敲除影響腫瘤的生長

在小鼠胰腺癌KPC細(xì)胞系(K-ras^G12V/p53R172H)中敲除FGFR1 (Fig. 6A)。與人FGFR1 KO細(xì)胞系的結(jié)果一致(Fig. 4F H)，敲除小鼠PDAC細(xì)胞中的FGFR1也會導(dǎo)致體外PD-L1表達(dá)下降(Fig. 6B)。FGFR1的敲除嚴(yán)重?fù)p害了KPC細(xì)胞對腫瘤生長的作用，在免疫活性C57BL/6小鼠中(Fig. 6C)。KPC細(xì)胞接種于免疫缺陷裸鼠后腫瘤生長速度更快，而敲除FGFR1僅能中度延緩裸鼠腫瘤的生長(Fig. 6D)。通過敲除FGFR1抑制PDL1表達(dá)進一步增強了抗腫瘤生長的免疫功能。在裸鼠中觀察到的FGFR1缺失細(xì)胞對腫瘤生長的中度抑制(Fig. 6D)可能反映了FGFR1信號通路的缺失。對免疫小鼠分離的腫瘤組織進行分析發(fā)現(xiàn)，FGFR1 KO腫瘤中PD-L1的表達(dá)降低了約30%( Fig. 6E)。由于腫瘤PD-L1的表達(dá)可能會影響T細(xì)胞的功能，因此對腫瘤組織中CD8+ T細(xì)胞浸潤進行量化。與野生型FGFR1腫瘤相比，FGFR1 KO1和FGFR1 KO2腫瘤中浸潤性T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，分別增加了1.85倍和1.41倍(Fig. 6F)。持續(xù)效應(yīng)T細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)在FGFR1 KO腫瘤顯著增加,如IFN,顆粒酶B和穿孔素 (Fig. 6 G- I)。這些數(shù)據(jù)表明, 體內(nèi)實驗中，在K-ras驅(qū)動的的癌細(xì)胞中,敲除FGFR1減少PDL1的表達(dá),促進免疫反應(yīng),從而抑制腫瘤的生長。

Figure 6

總結(jié)：

1.在體內(nèi)和體外實驗中, 致癌k-ras上調(diào)PD-L1的表達(dá)

2.ROS在調(diào)節(jié)k-ras誘導(dǎo)的FGFR1的激活中發(fā)揮重要作用。

3.在K-ras成熟癌細(xì)胞中，抗氧化酶能夠調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)

4.抑制FGFR1的表達(dá)增強CD8+T細(xì)胞的浸潤和抑制腫瘤生長