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國自然之m6A甲基化

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-02-04
m6A甲基化是近些年最火熱的研究方向之一,從2014到2019,立項數(shù)目一直呈上升趨勢。今天小編給大家介紹一篇關(guān)于m6A甲基化的文章。這篇文章

m6A甲基化是近些年最火熱的研究方向之一,從2014到2019,立項數(shù)目一直呈上升趨勢。

 

今天小編給大家介紹一篇關(guān)于m6A甲基化的文章。這篇文章發(fā)表于影響因子為8.986molecular therapy上。本文主要探究METTL3在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中的作用機(jī)制。在這項研究中,我們發(fā)現(xiàn),METTL3通過BMI1 m6A甲基化促進(jìn)OSCC增殖和轉(zhuǎn)移,提示METTL3-m6A-BMI1軸可作為OSCC患者的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點。
結(jié)果:

1OSCCm6A甲基化酶的解除

我們比較和分析了來自TCGA RNA測序數(shù)據(jù)庫的正常組織和OSCC組織中主要m6A甲基化相關(guān)修飾酶的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在OSCC中,METTL3WTAP顯著上調(diào),而METTL14的表達(dá)沒有變化(1A)。去甲基化酶(FTOALKBH5)m6A相關(guān)閱讀蛋白(YTHDF1)未顯示出顯著變化(1B1C)。為了進(jìn)一步證實m6A甲基化修飾酶在OSCC的表達(dá),在OSCC及其鄰近的正常口腔粘膜組織中進(jìn)行了qRT-PCR,結(jié)果顯示在OSCC中,METTL3METTL14WTAPFTOYTHDF1YTHDF2YTHDC1的表達(dá)水平明顯較高,而ALKBH5YTHDC2的表達(dá)水平無明顯變化(1D-1F)。因此,我們推測OSCC病的發(fā)生可能與m6A去甲基化酶有關(guān),尤其是METTL3的上調(diào)。

 

2)在OSCCMETTL3上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

為了確定METTL3OSCC發(fā)展中的作用,在兩個OSCC隊列中進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。對于訓(xùn)練樣本集,發(fā)現(xiàn)METTL3在細(xì)胞核中表達(dá),其表達(dá)在正常粘膜組織中很少檢測到,但在OSCC組織中顯著(2A)。更高的METTL3表達(dá)水平與晚期腫瘤分期、晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(2B)Kaplan-Meier分析顯示,METTL3高表達(dá)患者的總生存時間明顯短于METTL3低表達(dá)患者(2C)。此外,用ROC曲線評估了用于OSCC診斷的METTL3表達(dá)水平的潛在價值。如圖2D所示,METTL3的曲線下面積為0.729,靈敏度為65.3%,特異性為92%。在6對人類OSCC和鄰近的非癌樣品組織中發(fā)現(xiàn)了METTL3蛋白水平和總m6A水平之間的顯著相關(guān)性(2E)


3METTL3在體外促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、自我更新、遷移和侵襲

為研究METTL3OSCC中的功能作用,利用METTL3 shRNA序列構(gòu)建慢病毒,建立SCC9細(xì)胞中METTL3敲除模型。結(jié)果表明METTL3在蛋白和mRNA水平均被成功敲除(3A)。穩(wěn)定敲除METTL3后,SCC9細(xì)胞增殖能力呈時間依賴性下降(3B),遷移和侵襲能力下降(3C),減少了集落(3D),形成了更少更小的球體(3E)。此外,我們還利用慢病毒構(gòu)建了METTL3過表達(dá)系統(tǒng),以探討METTL3OSCC中的功能作用。在蛋白和mRNA水平上都證實了METTL3的上調(diào)(3F)上調(diào)SCC9細(xì)胞中METTL3表達(dá),增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力(3G)和遷移侵襲能力(3H)過表達(dá)METTL3SCC9細(xì)胞的集落形成能力(3I)和成球能力(3J)也顯著增強(qiáng)。

 

4METTL3在體內(nèi)促進(jìn)OSCC腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移

為了研究METTL3在體內(nèi)的促癌作用,我們將METTL3敲低細(xì)胞和非靶向shRNA對照細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。如圖4A所示,METTL3穩(wěn)定敲除組形成的腫瘤的體積和重量明顯低于對照組shRNA和敲除組。移植28天后,METTL3表達(dá)抑制腫瘤生長80%。在肺轉(zhuǎn)移模型中,與注射對照shRNA感染細(xì)胞的小鼠相比,注射METTL3 shRNA感染細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少(4B)。另外,我們還將METTL3過表達(dá)細(xì)胞和模擬感染細(xì)胞注射到裸鼠皮下,發(fā)現(xiàn)METTL3過表達(dá)組的腫瘤體積和重量明顯高于對照組(4C)。肺轉(zhuǎn)移模型顯示,與對照組相比,METTL3的過表達(dá)導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著增加(4D)。此外,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中(4E),基因敲除導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著減少。METTL3過表達(dá)顯著增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此,我們得出結(jié)論,METTL3可能作為一個癌基因,促進(jìn)OSCC生長和轉(zhuǎn)移。

 

5METTL3增強(qiáng)了口腔的化學(xué)致癌作用

為了進(jìn)一步驗證METTL3在體內(nèi)的致癌作用,我們將METTL3fl/fl小鼠與K14 CreER小鼠雜交,產(chǎn)生了一個它莫西芬介導(dǎo)的條件性METTL3基因KO小鼠模型。首先,為了檢查METTL3的缺失是否預(yù)防或減少4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO)誘導(dǎo)的小鼠OSCC癌發(fā)生,在給予4NQO之前,給Mettl3cKO and Mettl3Ctrl小鼠注射tamoxifen。在最初的4NQO治療22周后,對小鼠實施安樂死(5A)。我們發(fā)現(xiàn)對照組小鼠以100%外顯率(6/6)發(fā)展為OSCC,并且僅有33.3% (2/6)Mettl3cKO小鼠發(fā)展為輕度發(fā)育不良,這表明METTL3缺失可以降低體內(nèi)OSCC的發(fā)生率。此外,我們檢查了兩組中Ki67的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與對照組相比,Mettl3cKOOSCC組中Ki67受到抑制(5B)。接下來,我們研究了丟失METTL3是否能抑制OSCC進(jìn)程。結(jié)果表明,在Mettl3CtrlMettl3cKO小鼠中口腔中的臨床可見病變的數(shù)目是2.9±1.01.25±0.7(5E)。值得注意的是,與對照組小鼠相比,Mettl3cKO小鼠顯示OSCC損傷面積減少,組織病理學(xué)分級降低(5F5G)。一致的是,與對照組小鼠相比,Mettl3cKO小鼠的OSCC病變的增殖活性降低(5H)。這些結(jié)果表明,OSCC形成之前或之后,METTL3的損失導(dǎo)致抑制小鼠口腔區(qū)域惡性腫瘤的發(fā)展。

與之互補(bǔ)的是,我們的腫瘤發(fā)病率研究顯示,Mettl3 KI導(dǎo)致小鼠早期OSCC的出現(xiàn)(5K)。定量分析顯示,Mettl3cKI小鼠的病灶數(shù)量和病灶面積均高于對照組(5L5M)4NQO處理下Mettl3cKI小鼠舌部發(fā)生OSCC的比例為46.15%,對照組舌部僅出現(xiàn)30%OSCC形成(5N)。此外,與對照小鼠相比,Mettl3cKI小鼠的增殖增加(5O)。這些數(shù)據(jù)表明,口腔上皮細(xì)胞中的Mettl3 KI可增強(qiáng)腫瘤易感性和惡性程度。

 

 

6MeRIP-Seq/MeRIP-qRT PCR鑒定BMI1METTL3下游靶點

為了確定OSCCm6A分子生物學(xué)靶點,我們用OSCC細(xì)胞系HSC3進(jìn)行了m6A MeRIP-seq。元基因分析顯示m6A峰主要富集在翻譯終止位點附近(6A)。在OSCC細(xì)胞系中鑒定出AUGGAC基序(6B)GO分析顯示m6A修飾的基因在RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)泛素化、染色質(zhì)修飾和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中是豐富的(6C),這表明m6A可能對OSCC有深遠(yuǎn)的影響。可視化分析顯示m6A峰富集在BMI1基因的終止密碼子附近(6D)。此外,MeRIP-qRT PCR分析顯示,BMI1 m6A 修飾在敲除METTL 3后顯著降低(6E),而在METTL 3過表達(dá)時升高(6F),這表明在OSCC m6A修飾可以調(diào)節(jié)BMI1

 

7METTL3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)了BMI1 mRNA的翻譯,增強(qiáng)了OSCC的增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究OSCC BMI 1 m6A修飾的分子機(jī)制,我們首先在SCC9細(xì)胞中敲除了METTL3,發(fā)現(xiàn)METTL3的敲除降低了BMI1蛋白的表達(dá),而沒有改變其基因水平(7A7B),這表明METTL3可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)BMI1的表達(dá)。事實上,敲除METTL3顯著降低了BMI1基因在主動翻譯的多聚體部分中的比例(7C),但對其基因穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)降解率幾乎沒有影響(7D-7F),這表明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾是BMI1基因有效翻譯所必需的。同時,我們發(fā)現(xiàn)在SCC9細(xì)胞中過表達(dá)METTL3增加了BMI1蛋白的表達(dá)(7G),但沒有增加其mRNA水平(7H)METTL3過表達(dá)增加了多聚體結(jié)合BMI1基因的水平(7I),但沒有改變BMI1基因的穩(wěn)定性或蛋白質(zhì)降解率(7J–7L)。因此,這些數(shù)據(jù)揭示了OSCC中,METTL3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)了BMI1 mRNA的翻譯。此外,與對照組相比,BMI1的表達(dá)在Mettl3cKO OSCC中受到抑制(5C5I),而BMI1的表達(dá)在Mettl3cKO OSCC小鼠中與對照組相比有所增加(5P)

 

8METTL3識別BMI1 3’ UTR上的m6A殘基,并在與m6A reader IGF2BP1的合作下促進(jìn)BMI1翻譯

為了進(jìn)一步探索OSCC BMI1 m6A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機(jī)制,我們進(jìn)行了熒光素酶報告子和誘變分析。如圖8A8B所示,與用攜帶突變BMI1 3’UTR (Mut3Mut4)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,用野生型BMI1 3’UTR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯著增加了熒光素酶活性,并且與METTL3過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也顯著增加了熒光素酶活性。接著,為了了解m6A讀碼器如何在OSCC中促進(jìn)BMI1翻譯,用不同siRNAm6A讀碼器轉(zhuǎn)染SCC9細(xì)胞。如圖8C–8F所示, BMI1蛋白的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染IGF2BP1 siRNASCC9細(xì)胞中顯著降低(8D)。此外,IGF2BP1敲除降低了METTL3過表達(dá)SCC9細(xì)胞中BMI1蛋白水平(8E)。此外,敲除METTL3/IGF2BP1協(xié)同降低BMI1蛋白水平(8F)。綜上所述,在與IGF2BP1的合作下,METTL3促進(jìn)了BMI1OSCC中的翻譯。