研究背景：鐵死亡是一種鐵依賴的程序性細胞死亡，研究認為鐵死亡與膿毒癥的發病機制有關。運動中釋放的肌動素鳶尾素在各種條件下都能改善線粒體功能。鐵死亡與線粒體功能密切相關。然而，鳶尾素在膿毒癥誘導的肝臟鐵死亡和線粒體功能障礙中的作用尚不清楚。陜西省再生醫學中心Shasha Wei在Clinical and Translational Medicine（IF=7.919）上發表文章，研究鳶尾素治療對膿毒癥患者的鐵死亡的作用。

技術路線圖：

研究結果：

1.膿毒癥患者血清中鳶尾素水平與健康對照組比較

比較60名膿毒癥患者和29名健康受試者，發現健康人體內鳶尾素水平高。膿毒癥患者血清中鳶尾素水平與APACHE II評分（判斷危重患者的病情嚴重程度）存在相關性。在膿毒癥患者中，血清鳶尾素水平下降與疾病嚴重程度呈負相關。

Figure 1

2. 膿毒癥動物模型血清中鳶尾素水平

與臨床結果一致， CLP小鼠術后12H、24 h，血清鳶尾素水平顯著降低(圖2A)。在LPS誘導的小鼠中，血清鳶尾素水平也顯著降低，且以LPS劑量依賴性下降(圖2B)。鳶尾素主要在骨骼肌中表達，lps誘導的膿毒癥小鼠骨骼肌中FNDC5 mRNA水平明顯降低(圖2C)，提示膿毒癥小鼠骨骼肌中鳶尾素的表達減少。

Figure 2

3. 鳶尾素抑制CLP誘導的膿毒癥老鼠的鐵死亡

谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)鐵蛋白水平呈負相關。圖3A和3B顯示，術后24小時CLP小鼠肝臟GPX4水平明顯降低。而鳶尾素治療后CLP小鼠肝臟中GPX4表達明顯升高(圖3C,D)。GPX4的表達，谷胱甘肽含量，脂質過氧化，鐵積累和線粒體形態是表征鐵死亡的關鍵指標。膿毒癥小鼠肝臟GSH含量明顯降低，MDA和Fe²⁺水平明顯升高，線粒體萎縮，雙層密度增高。鳶尾素處理逆轉了這些指標的水平，并在形態學上減輕了線粒體損傷(圖3E-H)。這些結果表明，膿毒癥小鼠肝臟鐵死亡增多，而鳶尾素處理降低了膿毒癥小鼠的鐵死亡。除肝臟外，鳶尾素還能抑制CLP小鼠肺內鐵死亡。 

Figure 3

4. 鳶尾素抑制CLP誘導的膿毒癥小鼠的炎癥反應

膿毒癥時炎癥因子的過度增加導致器官損傷。鳶尾素可以顯著降低膿毒癥小鼠血清IL-6和TNF- a的水平(圖4A,B)。經鳶尾素處理后，膿毒癥小鼠肝臟中IL-6、IL-1、CXCL1和CXCL10mRNA的表達顯著降低(圖4C)。同樣，鳶尾素處理降低腎臟中IL-6和IL-1的水平，肺部IL-6、TNF-a和IL-1的水平，心臟中IL-6、TNF-a和CXCL1的表達。鳶尾素抑制了膿毒癥小鼠的全身炎癥。

Figure 4

5. 鳶尾素可減輕膿毒癥小鼠線粒體損傷

如圖5A，CLP手術導致線粒體腫脹，線粒體嵴消失，線粒體外膜破裂，內質網腫脹。在鳶尾素治療組，這些改變明顯減輕。為了探究鳶尾素是否對線粒體生物發生有影響，通過qPCR檢測mtDNA拷貝數(mtDNA/nDNA)，在載體組中mtDNA拷貝數(mtDNA/nDNA)明顯下降，而外源性鳶尾素處理增加了mtDNA拷貝數(圖5B)。線粒體腫脹和線粒體外膜破裂提示線粒體功能受損。WB結果顯示ATPB(與能量產生相關的蛋白質)和TFAM(線粒體生物發生相關蛋白)這兩種蛋白在CLP中均顯著下調，而在鳶尾素處理組中顯著上調(圖5C-E)。
Figure 5

6. 鳶尾素增加膿毒癥小鼠和LPS刺激的L02細胞中線粒體活性和ATP的產生

肝線粒體活性用絲分裂追蹤器紅色評價，CLP誘導的膿毒癥小鼠的紅色熒光強度明顯降低。外源鳶尾素處理明顯增加了熒光強度(圖6A,B)。肝臟ATP含量可以反映線粒體能量代謝。溶劑對照組中ATP含量顯著降低，而鳶尾素處理后ATP含量顯著增加(圖6C)。L02細胞經脂多糖處理后，絲分裂追蹤器紅色的熒光強度和ATP含量顯著降低，而鳶尾素處理可逆轉這種影響(圖6D,E)

Figure 6

7. 鳶尾素可以減輕膿毒癥小鼠和LPS刺激的L02細胞中氧化應激水平

溶劑對照組中ROS顯著增加，但鳶尾素處理顯著降低了ROS的產生(圖7A,B)。100 ng/mL鳶尾素處理可以逆轉LPS刺激的LO2細胞中ROS水平 (圖7C,D)。總之，鳶尾素治療可調節膿毒癥中的氧化應激。

Figure 7

8. GPX4抑制劑消除鳶尾素在膿毒癥中的作用

在L02細胞中，觀察鐵死亡是否參與鳶尾素對膿毒癥的保護作用。在L02細胞中觀察到GPX4顯著下調，而鳶尾素處理后GPX4蛋白水平顯著升高(圖8A,B)。RSL3是一種誘導鐵死亡的GPX4特異性抑制劑，用于體外檢測線粒體活性和ROS的產生。RSL3、LPS和鳶尾素處理24小時后，L02細胞紅色熒光強度明顯降低，ROS的產生顯著增加(圖8C)。與此同時，RSL3處理的L02細胞中GPX4、ATPB和TFAM蛋白表達明顯下調(圖8D-G)。GPX4的下調顯示RSL3的強烈抑制作用，而ATPB和TFAM的下調則表明RSL3處理后線粒體功能受損。RSL3與鳶尾素處理導致膿毒癥小鼠GPX4和TFAM蛋白水平明顯降低(圖9A,B)，而ROS生成明顯升高(圖9C,D)。 RSL3處理消除了鳶尾素對GSH、MDA和Fe²⁺的有益作用(圖9E-G)。RSL3處理血清中ALT、AST、IL-6、TNF和肝臟中IL-6、IL-1、CXCL-1 mRNA表達明顯升高(圖9J)。以上結果表明，RSL3通過抑制GPX4破壞了鳶尾素對肝臟線粒體功能、ROS產生、肝臟損傷和全身炎癥的保護作用。綜上所述，鐵死亡的增強消除了鳶尾素對膿毒癥的保護作用。

Figure 8

Figure 9

9. 整合素抑制劑消除鳶尾素對GPX4和線粒體功能的影響

在骨細胞細胞系中，αV整合蛋白被鑒定為鳶尾素的受體，刺激信號轉導。為了確定鳶尾素是否會影響鐵死亡和肝線粒體，鳶尾素受體的抑制劑(精氨酸肽和Echistain)在LPS和鳶尾素存在的情況下處理L02細胞，對比鳶尾素組和RGD陰性對照組， GPX4蛋白表達、絲分裂追蹤器熒光強度和ATP含量均顯著降低(圖10)。抑制鳶尾素的作用促進了鳶尾素和脂多糖處理的L02細胞的鐵死亡和線粒體功能受損。

Figure 10