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VDR–SOX2信號(hào)與大腸癌進(jìn)展

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-01-05
酸性腫瘤微環(huán)境為惡性腫瘤的發(fā)展提供了能量來(lái)源。細(xì)胞對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)導(dǎo)致了癌癥干細(xì)胞的出現(xiàn)。維生素D受體(VDR)的表達(dá)與大腸癌(CRC)


酸性腫瘤微環(huán)境為惡性腫瘤的發(fā)展提供了能量來(lái)源。細(xì)胞對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)導(dǎo)致了癌癥干細(xì)胞的出現(xiàn)。維生素D受體(VDR)的表達(dá)與大腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其在CRC干細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。今天給大家?guī)?lái)的發(fā)表于“Signal Transduction and Targeted Therapy”,影響因子13.493的文章“VDR–SOX2 signaling promotes colorectal cancer stemness and malignancy in an acidic microenvironment”,詳細(xì)介紹了VDR–SOX2信號(hào)調(diào)控大腸癌發(fā)展的機(jī)制。

我們的研究表明,酸中毒通過(guò)下調(diào)PPARD的表達(dá)降低了VDR的表達(dá)。過(guò)表達(dá)VDR能有效抑制酸中毒細(xì)胞的干性和奧沙利鉑耐藥。VDR核輸出信號(hào)對(duì)酸中毒敏感,VDR從細(xì)胞核中輸出。此外,染色質(zhì)免疫沉淀和高通量測(cè)序分析顯示,VDR通過(guò)結(jié)合SOX2啟動(dòng)子中的維生素D反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄抑制SOX2,損害腫瘤生長(zhǎng)和耐藥性。

 

技術(shù)路線

結(jié)果:

1)酸中毒抑制VDR表達(dá),VDR表達(dá)與惡性大腸癌呈負(fù)相關(guān)

為了研究酸性腫瘤微環(huán)境對(duì)大腸癌細(xì)胞干細(xì)胞的影響,我們首先從大腸癌患者的組織樣本中分離并鑒定了RKO干細(xì)胞樣細(xì)胞和原代大腸癌細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)在不同pH值的培養(yǎng)基中,以評(píng)估細(xì)胞自我更新的最佳條件。在pH值為6.8的酸性條件下,腫瘤球的數(shù)量最大化(圖1a、b)。與pH值7.4相比,pH值6.8顯著增加了CD133陽(yáng)性細(xì)胞的百分率,促進(jìn)了CD133、OCT4和SOX2的表達(dá)(圖1c)。因此,酸性腫瘤微環(huán)境可以誘導(dǎo)和維持大腸癌細(xì)胞的CSC表型。

為了確定酸性微環(huán)境中CSC表型調(diào)控的重要途徑,我們對(duì)pH7.4和6.8培養(yǎng)的RKO細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序和信號(hào)通路富集分析。我們發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素的代謝過(guò)程被酸性條件顯著改變(圖1d)。維生素D是一種重要的脂溶性維生素,已知維生素D信號(hào)通路參與癌細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。因此,我們?cè)趐H值為7.4和6.8的條件下測(cè)試了維生素D信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用的幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖1e),發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞系VDR表達(dá)在酸中毒時(shí)明顯下降(圖1f,g)。大腸癌組織與配對(duì)相鄰組織中VDR的mRNA表達(dá)差異顯著(圖1h)。此外,VDR在復(fù)發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)顯著降低(圖1i)。TCGA和Skrzypczak,Kaiser和Hong數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,VDR在大腸癌組織中的表達(dá)低于正常組織(圖1j),VDR在Ⅳ期大腸癌組織中的表達(dá)最低(圖1k)。我們還研究了VDR表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明VDR表達(dá)低的患者生存時(shí)間短(圖1l)。LAMP2的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境酸性呈正相關(guān),并且我們發(fā)現(xiàn)VDR表達(dá)和LAMP2在大腸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖1m)。提示酸性腫瘤微環(huán)境可抑制VDR的表達(dá),而VDR的表達(dá)與大腸癌的惡性程度及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

 

2)VDR損害大腸癌的干細(xì)胞和惡性腫瘤

為了研究VDR對(duì)大腸癌干細(xì)胞表型的影響,我們首先證實(shí)了VDR在大腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)低于非干細(xì)胞癌細(xì)胞(圖2a)。此外,在抗奧沙利鉑的HCT116細(xì)胞中VDR表達(dá)降低(圖2b)。因此,我們?cè)诘蚔DR表達(dá)的大腸癌干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VDR(圖2c)。顯微成像顯示腫瘤球粘附在板的底部,腫瘤球內(nèi)發(fā)生細(xì)胞分化(圖2d)。VDR過(guò)表達(dá)顯著減少了由CRC干細(xì)胞形成的腫瘤球的大小和數(shù)量(圖2d,e),并顯著降低CD133陽(yáng)性細(xì)胞的百分比(圖2f)。這些結(jié)果表明VDR過(guò)表達(dá)抑制了大腸癌干細(xì)胞的自我更新和誘導(dǎo)細(xì)胞分化。此外,VDR的過(guò)表達(dá)增加了大腸癌干細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性,并部分減弱了酸性腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥促進(jìn)作用(圖2g)。接下來(lái),我們觀察到VDR的敲除(圖2h)可以提高CRC細(xì)胞的自我更新能力(圖2i–k),促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)(圖2l)。此外,VDR的敲除增加了CD133陽(yáng)性細(xì)胞的百分比(圖2m),增強(qiáng)了對(duì)奧沙利鉑的抵抗力(圖2n)。這些結(jié)果表明,VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中抑制CSC表型,提高大腸癌干細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

3)VDR通過(guò)抑制SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)下調(diào)SOX2的表達(dá)

為了闡明VDR如何影響大腸癌的CSC表型和耐藥性,我們用染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)分析了VDR對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)VDR可與SOX2、OCT4、CD44和NANOG的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合(圖3a、b)。然后,我們利用高通量測(cè)序(ATAC-seq)信號(hào)分析了在酸性或堿性條件下培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞中干性基因的染色質(zhì)可及性。在酸性條件下,SOX2中的開放染色質(zhì)優(yōu)先出現(xiàn)在TSS的上游(圖3c),這可能反映了VDR在SOX2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的可能性。我們證實(shí)過(guò)表達(dá)VDR(圖3d)會(huì)降低SOX2蛋白的表達(dá),并且在過(guò)表達(dá)VDR的細(xì)胞中結(jié)合作用增強(qiáng)(圖3e)。VDR的過(guò)表達(dá)抑制了SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,而VDR的敲除促進(jìn)了它的轉(zhuǎn)錄活性(圖3f)。我們進(jìn)一步刪除了SOX2啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合序列(圖3g),發(fā)現(xiàn)VDR對(duì)SOX2啟動(dòng)子的抑制作用減弱(圖3h–j)。通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們?cè)赟OX2啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)VDREs(圖3g)。我們對(duì)SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測(cè)和檢測(cè)。突變1和突變3顯著減弱了VDR的抑制作用(圖3k)。這些結(jié)果表明VDR可能通過(guò)抑制SOX2啟動(dòng)子活性來(lái)下調(diào)SOX2的表達(dá)。

4)酸性腫瘤微環(huán)境通過(guò)VDR-SOX2軸調(diào)控CRC的干細(xì)胞特性和耐藥

為了證實(shí)VDR通過(guò)下調(diào)SOX2的表達(dá)來(lái)抑制CRC細(xì)胞的惡性表型,我們?cè)谶^(guò)表達(dá)VDR的CRC干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SOX2(圖4a)。大腸癌干細(xì)胞的自我更新能力隨著SOX2過(guò)表達(dá)而增強(qiáng)(圖4b)。在低VDR水平的CRC細(xì)胞中,SOX2的敲除降低了CD133和CD44的表達(dá)(圖4c)并降低了自我更新能力(圖4d)。我們還分析了酸性和堿性pH中有和沒(méi)有VDR表達(dá)的大腸癌干細(xì)胞中SOX2 mRNA。結(jié)果表明,在酸性pH條件下,在沒(méi)有VDR表達(dá)的細(xì)胞中SOX2 mRNA表達(dá)增加(圖4e)。與先前的結(jié)果一致,在酸性腫瘤微環(huán)境中敲除SOX2減弱了結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新能力(圖4f),并增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性(圖4g)。在pH6.8時(shí),我們檢測(cè)了SOX2沉默時(shí)干細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明,當(dāng)沉默SOX2時(shí),干細(xì)胞基因OCT4,MYC和CCND1下調(diào)(圖4h)。此外,我們發(fā)現(xiàn)維生素D的活性形式可以逆轉(zhuǎn)酸性環(huán)境介導(dǎo)的自我更新和CD133、SOX2和OCT4在大腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)(圖4i,j),提示酸性微環(huán)境通過(guò)維生素D-VDR信號(hào)通路影響大腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。總之,我們的研究結(jié)果表明,在酸性腫瘤微環(huán)境中VDR的下調(diào)減輕了SOX2的轉(zhuǎn)錄抑制,導(dǎo)致SOX2表達(dá)增加。這些變化促進(jìn)了大腸癌細(xì)胞的干性和耐藥性。

5)酸性微環(huán)境抑制核內(nèi)VDR聚集,通過(guò)PPARD抑制VDR表達(dá)

VDR調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的靶基因。因此,我們檢測(cè)了VDR在酸性環(huán)境中的亞細(xì)胞定位。我們發(fā)現(xiàn)在酸性條件下,VDR的表達(dá)減少,VDR蛋白在細(xì)胞核中的積累減少(圖5a,b)。進(jìn)一步的分析表明,在酸性條件下VDR包含核輸出信號(hào)(NES)(圖5c)。LMB與CRM1結(jié)合,并抑制其他輸出底物的結(jié)合。我們?cè)趐H7.4和6.8下用LMB處理大腸癌細(xì)胞。LMB在pH6.8培養(yǎng)基中阻止了VDR蛋白的核輸出(圖5d),說(shuō)明酸性環(huán)境下VDR蛋白的核輸出依賴于CRM1。為了證實(shí)VDR的核輸出需要NES,我們用野生型和NES位點(diǎn)突變質(zhì)粒(圖5c)轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)VDR的NES突變阻止了VDR在酸性環(huán)境下的核輸出(圖5e)。為了研究核VDR的表達(dá)是否使細(xì)胞對(duì)pH驅(qū)動(dòng)的重編程不敏感,我們用野生型和NES位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CC組織CSCs,并將其置于酸性條件下。結(jié)果表明,VDR的NES突變抑制了大腸癌干細(xì)胞在酸性條件下的自我更新(圖5f)。這一發(fā)現(xiàn)表明,VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中的核輸出是由NES介導(dǎo)的,并且依賴于CRM1。

利用Qiagen數(shù)據(jù)庫(kù),我們預(yù)測(cè)PPAR家族成員與VDR啟動(dòng)子密切相關(guān)。我們首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC數(shù)據(jù)中PPARA、PPARD、PPARG和VDR之間的相關(guān)性(圖5g)。PPARA和PPARD表達(dá)與VDR表達(dá)呈正相關(guān)(圖5g)。我們還發(fā)現(xiàn),在酸性條件下,大腸癌細(xì)胞中PPARD mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低(圖5h,i),令人驚訝的是,PPARD可以與VDR的啟動(dòng)子結(jié)合(圖5j),PPARD的敲除降低了VDR的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),上調(diào)了干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)(圖5k–m)。這些結(jié)果表明,酸性腫瘤微環(huán)境通過(guò)PPARD抑制VDR的表達(dá),誘導(dǎo)VDR蛋白的核輸出,抑制VDR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 

6)酸性腫瘤微環(huán)境的正常化和VDR表達(dá)的誘導(dǎo)抑制了大腸癌的發(fā)生和發(fā)展

為了確定是否可以通過(guò)改變酸性腫瘤微環(huán)境和VDR表達(dá)來(lái)抑制大腸癌的生長(zhǎng),我們將大腸癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi),并給予小鼠水或碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液。我們發(fā)現(xiàn),VDR過(guò)表達(dá)后的NaHCO3處理顯著抑制了SOX2的表達(dá)和腫瘤的發(fā)展(圖6a),并且NaHCO3處理還有效地減弱了VDR敲除后的SOX2表達(dá)和腫瘤形成(圖6b)。這些結(jié)果表明,降低腫瘤微環(huán)境的酸性和誘導(dǎo)VDR的表達(dá)可以抑制大腸癌的發(fā)展。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),維生素D信號(hào)激活和奧沙利鉑聯(lián)合治療可以抑制患者來(lái)源的異種移植物的腫瘤生長(zhǎng)(圖6c)。PDXs中VDR表達(dá)上調(diào),SOX2表達(dá)下調(diào)(圖6d)。這些結(jié)果為大腸癌的臨床治療提供了新的理論依據(jù)。

7)VDR表達(dá)與SOX2表達(dá)呈負(fù)相關(guān),有可能用于臨床預(yù)后預(yù)測(cè)

我們?cè)隗w內(nèi)驗(yàn)證了VDR和SOX2表達(dá)對(duì)大腸癌干細(xì)胞致瘤能力的影響。體內(nèi)極限稀釋實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,VDR的過(guò)表達(dá)顯著抑制腫瘤的發(fā)生,而SOX2的過(guò)表達(dá)則減弱了VDR過(guò)表達(dá)的抑制作用(圖6e)。VDR和SOX2高/低表達(dá)患者的總生存率(OS)有顯著差異。VDR低表達(dá)和SOX2高表達(dá)的患者預(yù)后最差(圖7a,b)。VDR和SOX2在III期和IV期標(biāo)本中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖7c)。此外,我們?cè)u(píng)估了65例接受FOLFOX或XELOX方案治療的晚期大腸癌患者樣本中VDR和SOX2的表達(dá)。原發(fā)性腫瘤中VDR高表達(dá)的患者中僅有27.69%對(duì)化療有耐藥性,而SOX2高表達(dá)的患者對(duì)化療耐藥率為72.31%。VDR低表達(dá)和SOX2高表達(dá)組化療耐藥比例最高(圖7d)。這些結(jié)果表明,低VDR表達(dá)和高SOX2表達(dá)都預(yù)示著奧沙利鉑化療的耐藥性。

 

結(jié)論:這些發(fā)現(xiàn)揭示了酸性腫瘤微環(huán)境通過(guò)調(diào)節(jié)SOX2的表達(dá)而影響大腸癌細(xì)胞CSC表型的新機(jī)制,并表明VDR表達(dá)異常導(dǎo)致維生素D信號(hào)的無(wú)效激活,導(dǎo)致維生素D在抗腫瘤過(guò)程中缺乏作用。