腎細胞癌（RCC）是世界上最致命的惡性腫瘤之一，2020年預計美國有七萬新增病例及一萬四千的死亡病例。circRNA已在多種人類癌癥中表現出關鍵作用，然而其在RCC中的作用仍保有較大程度的未知性。本文發現circPTCH1通過調控miR-485-5p/MMP14軸促進RCC的侵襲和遷移，于2020年10月發表于《Theranostics》IF:8.579。

技術路線如下：

主要結果如下：

1、RCC細胞中circPTCH1的芯片分析與鑒定

作者通過對5種轉移性RCC細胞系和配對的正常切片的芯片分析，鑒定差異表達的circRNA，作者挑選的是最顯著的5個進行qRT-PCR分析，最終確認只有hsa_circ_0139402在RCC細胞系中顯著上調（Figure 1A-B）。其結構組成是來源于宿主基因PTCH1外顯子13和14背向剪切形成，將其命名為circPTCH1。circPTCH1不能被RNase R酶消化，定位于細胞質。

圖1 circPTCH1在RCC細胞中的表達及特征分析

2、circPTCH1增強RCC的遷移和侵襲

如圖2所示，敲除circPTCH1后RCC細胞系的遷移和侵襲減弱，相反，過表達circPTCH1后RCCC細胞系的遷移和侵襲增強。

圖2 circPTCH1在體外可增強RCC細胞的遷移和侵襲能力

3、在RCC細胞中circPTCH1作為miR-485-5p的海綿

眾所周知，定位于細胞質的circRNA通常是作為miRNA的海綿發揮作用，因此本文通過三個數據庫共同鑒定到9個潛在的靶向miRNA（Figure 3A-B）。生物素探針實驗發現只有miR-485-5p, miR-545-3p, 和miR-330-5p可以被顯著下拉富集（Figure 3C-E）。進一步的，只有miR-485-5p在腫瘤中顯著下調，并經實驗證實與circPTCH1存在相互結合作用。這些結果表明，在RCC細胞中circPTCH1作為miR-485-5p的海綿發揮作用。

圖3 circPTCH1作為miR-485-5p的海綿

4、miR-485-5p通過靶向MMP14抑制RCC細胞的遷移和侵襲

如圖4A-D所示，抑制或過表達miR-485-5p會增強或減弱RCC細胞的遷移和侵襲。隨后，通過4個數據庫共同確定了39個潛在的靶基因，其中MP14的表達最為豐富。實驗發現MMP14的表達水平在腫瘤組織中顯著上調，與miR-485-5p的表達負相關，且兩者具有相互結合作用。抑制或過表達miR-485-5p會增強或減弱RCC細胞中MMP14的蛋白表達水平。這些結果表明miR-485-5p通過靶向MMP14抑制RCC細胞的遷移和侵襲。

圖4 miR-485-5p在體外通過靶向MMP14抑制細胞遷移和侵襲

5、circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14促進RCC細胞的遷移，侵襲，和EMT

作者隨后通過挽救實驗進一步發現，circPTCH1的干擾降低了RCC細胞的遷移能力，然而，與miR-485-5p抑制劑共轉染可以部分消除這種效應。此外，敲除circPTCH1降低了MMP14的水平，但共轉染miR-485-5p抑制劑可以恢復期表達。類似的現象也在N-candherin和Vimentin中觀察到，而E-candherin表達趨勢則完全相反。這些結果表明circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14促進RCC細胞遷移，侵襲，和EMT表型。

圖5 circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14軸促進RCC細胞的遷移、侵襲和EMT

6、circPTCH1在體內促進腫瘤轉移

與體外實驗結果一致，如圖6所示，過表達circPTCH1小鼠體內的腫瘤轉移結節顯著增多，而抑制miR-485-5p則能部分緩解這種效應，表明circPTCH1在體內通過miR-485-5p/MMP14軸促進腫瘤轉移和RCC進展。

圖6 circPTCH1在體內促進腫瘤轉移

總之，本文發現PTCH1基因13和14號外顯子反向剪切形成的circPTCH1在細胞質中海綿吸附miR-485-5p，而miR-485-5p可以靶向調節MMP14的表達，進而促進EMT表型，最終導致RCC的進展和轉移（圖7）。

圖7 原理圖顯示circPTCH1通過miR-485-5p/MMP14軸促進RCC轉移