近日Philipps-University 的Michael Wanzel和Thorsten Stiewe等人將mTOR誘導的腫瘤耐藥與自噬缺陷的代謝障礙聯系起來，并為治療難治性腫瘤患者打開了治療窗口。相關論文于2020年9月份發表在《nature communications》雜志上。

技術路線：

一、順鉑耐藥的肺癌代謝脆弱性

我們使用krasq61h突變、p53野生型非小細胞肺癌(NSCLC)患者的H460細胞，將親代H460 (H460par)細胞通過劑量遞增至NSCLC一線化療標準成分CDDP，獲得耐CDDP的H460res細胞。當檢測耐藥模式時，H460res細胞不僅對CDDP耐藥，而且對許多其他破壞DNA的化療藥物也耐藥，包括其他鉑化合物、etoposide和doxorubicin(圖1a)。

相比之下，代謝抑制劑2DG和DCA通過誘導細胞凋亡，嚴重抑制了H460res細胞的增殖，盡管這兩種化合物對親代細胞的影響不顯著(圖1a d)。

2DG和DCA目標葡萄糖代謝:2 dg競爭性抑制己糖激酶減緩葡萄糖吸收,而DCA目標抑制丙酮酸脫氫酶激酶,從而減少乳酸生產從糖酵解和促進線粒體丙酮酸的氧化代謝。對來自EGFRL858R、T790M和TP53R273H突變型NSCLC的H1975細胞進行實驗，以提高CDDP的劑量(圖1e)。

與親代H1975細胞相比，使用2DG或DCA處理時，CDDP耐藥H1975細胞的克隆生長明顯減弱，凋亡增加(圖1f, g)。

為了驗證這些發現是否適用于CDDP治療后體內復發的腫瘤細胞，我們使用了有條件的KrasLSL-G12D/+;Trp53flox/flox小鼠。吸入后Cre腺病毒,這些老鼠發展成肺腺癌(KrasG12D / +; Trp53Δ/Δ)，最初對CDDP治療但最終復發(圖1h).從復發小鼠中獲得原發腫瘤細胞培養物，與CDDP幼稚小鼠的腫瘤細胞相比，對CDDP的抗性顯著增強，但對2DG和DCA過敏(圖1h, i)。

總之，在具有不同驅動癌基因和p53共突變的多種不同肺腺癌模型中，CDDP耐藥的發生明顯易受糖代謝紊亂的影響。

二、代謝脆弱性是由mTOR介導的

與此同時，耐CDDP的H460、H1975和小鼠腺癌細胞均顯示mTOR信號通路明顯升高，表現為mTORC1靶點磷酸化(p70S6KT389、4E-BP1T37/46和ULK1S757)和FancD2表達升高(圖2a c)。

此外，ATP競爭性mTOR激酶抑制劑AZD805537和 mTORC1選擇性抑制劑雷帕霉素和伊維莫司阻斷了mTOR靶點的磷酸化，有效地使H460res細胞對CDDP重新敏感(圖2a, d，補充圖1)。

藥物或rnai介導的mTORC1抑制使cddp耐藥腫瘤細胞的藥物應答模式恢復到親代細胞的應答模式(圖2d)。

mTOR抑制不僅恢復了H460res細胞對CDDP的敏感性，同時減弱了2DG/DCA的凋亡反應，挽救了在2DG/DCA存在下的克隆生長(圖2d, e，補充圖1和2)。

sirna介導的mTOR敲低以及mTORC1亞基Raptor敲低可以保護H460res細胞免受2DG和DCA的侵襲，而敲低mtorc2特異性亞基Rictor則沒有影響(圖2 f, g）。

綜上所述，CDDP耐藥腫瘤細胞中mTORC1信號通路的升高不僅是CDDP耐藥表型所必需的，同時也是其代謝脆弱性的重要因素。

當內源性mTORC1激酶活性通過激活mtor GTPase Rheb1(腦內豐富的Ras同源物)的強化表達而提高時，H460par細胞對2DG/DCA變得敏感(圖2 h, i)。

當rheb1 -抑制型TSC亞基被消耗后，TSC1和TSC2 mTORC1信號進一步增強，從磷酸化p70S6KT389、4EBP1T37/46和ULK1S757的水平可以明顯看出，這導致了對2DG和DCA的更高敏感性(圖2h, i)。

此外，在2DG/DCA存在的情況下，不同的mTOR突變體(之前在癌癥患者12中發現，它們在H460par細胞中誘導了強mTORC1信號轉導)對2DG/DCA誘導的細胞凋亡敏感，并導致克隆細胞生長受損(圖2j l)。

因此，mTORC1信號的激活不僅是必需的，而且足以引起2DG和DCA的代謝脆弱性。

三、在CDDP耐藥腫瘤細胞中mTOR介導的自噬缺陷

測量了氯喹阻斷自噬溶酶體降解后LC3的積累(圖3a)。與H460par細胞相比，H460res細胞中LC3的積累明顯減少，表明在沒有2DG/DCA的情況下，自噬通量明顯降低。AZD8055抑制mTOR可以恢復H460res中LC3的積累，但在H460par細胞中沒有明顯的作用，說明H460res細胞基礎自噬通量的降低是mTOR依賴性的。在2DG/DCA處理后，H460par細胞中LC3水平呈劑量依賴性下降，提示誘導自噬(圖3b, c)。

與H460res細胞對2DG/ DCA處理后自噬反應的缺陷一致，只有H460par細胞在處理后出現大量的紅色熒光LC3斑點(圖3d, e)。

四、mTOR對2DG/DCA敏感，抑制自噬

各種藥物自噬抑制劑作用于自噬過程的不同步驟，使H460par細胞對2DG/DCA敏感(圖4a)，支持了自噬在代謝紊亂背景下的保護作用。同樣，必要自噬基因ATG7的下調使H460par細胞對2DG/ DCA敏感(圖4b, c)。

由于藥物抑制劑和siRNAs可能會產生脫靶效應和不完全抑制，我們還生成了多種由crispr誘導的ATG7插入/缺失突變的H460par細胞克隆(圖4d f)。

只有完全敲除ATG7的克隆細胞顯示自噬貨物蛋白p62/SQSTM1的積累和LC3-I向LC3-II處理的失敗，作為自噬缺陷的證實(圖4d)。

在2DG/DCA處理下，這些克隆也顯示了克隆細胞的生長和增殖受損(圖4e, f)。

綜上所述，這些實驗明確地將自噬缺陷與2DG/DCA的抗腫瘤活性聯系起來，并強調自噬缺陷是代謝藥物易損的充分原因。在CDDP劑量增加的情況下，我們擴大了ATG-7修飾的H460par克隆，產生了具有不同ATG-7突變狀態的耐CDDP的H460res克隆。

除ATG-7狀態外，所有CDDP耐藥克隆均對2DG/DCA過敏，但只有使用ATG-7的克隆通過mTOR抑制從2DG/DCA細胞毒性中拯救出來(圖4g, h)。

五、mTOR介導的代謝脆弱性延伸到雙胍類化合物

與2DG/DCA相似，H460par細胞通過誘導自噬通量對Met/Phen反應，在氯喹存在時LC3的劑量依賴性降解和積累證明了這一點(圖5a)。

相比之下,H460res細胞證明只有微不足道的LC3的波動水平符合遇到的失敗/苯酚的誘導自噬(圖5)。

對Met/Phen處理的差異反應也與mTORC1有關。mTOR抑制恢復了Met/ pheno處理的H460res細胞中LC3的降解(圖5a)，顯示了有效的自噬誘導，并挽救了這些細胞免于能量應激和凋亡(圖5b)

相反，H460res細胞顯示AMPKT172和ACCS79磷酸化和PARP裂解的增加，分別作為能量應激和隨后發生的細胞凋亡的信號(圖5b，左圖)，以及Met/Phen抑制克隆生長的信號(圖5d)。

由于Rheb1表達和TSC缺失，mTORC1信號強烈地降低了Met/Phen處理的H460par細胞的克隆生長(圖5c, d)。因此，提高mTORC1信號是滿足Met/Phen敏感性的必要條件。

六、代謝脆弱性與靶向耐藥性相關

我們生成T47D乳腺癌細胞的alpelisib和pictilisib耐藥亞克隆，顯示交叉耐藥(圖6a)。

p70S6KT389、4E-BP1T37/46和ULK1S757磷酸化水平的降低證明了兩種藥物都抑制了親代細胞中的mTORC1信號傳導(圖6b)。

與之前的報道一致，PI3Ki耐藥細胞在PI3K抑制下維持mTORC1信號通路，這是耐藥的根本原因(圖6b)。

mTORC1信號通路抑制了自噬，抗pi3ki的T47D克隆在2DG/DCA處理后未能誘導自噬通量(圖6c)。

值得注意的是，抑制PI3K也刺激了LC3處理和p62降解，表明自噬誘導再次只在親本亞克隆，而不耐PI3Kiresistant亞克隆(圖6b)。
   mTOR抑制后，2DG/DCA恢復了自噬誘導，表明耐PI3Kiresistant腫瘤細胞自噬反應存在嚴重的mTOR依賴性缺陷。與我們之前的結果一致，這轉化為通過2DG/DCA治療，mTOR依賴大量誘導細胞凋亡和降低克隆生長(圖6d, e)，這將我們對mTOR誘導代謝脆弱性的研究從傳統化療擴展到靶向治療耐藥性。

七、代謝抑制劑在體內靶向CDDP耐藥的癌細胞

治療期間定期采集的血液樣本的熒光素酶活性測量提供了治療期間腫瘤負荷的細胞類型特異性縱向監測(圖7a).

DCA選擇性地抑制H460res細胞的生長，導致終末期腫瘤中H460res細胞減少40倍。為了證實觀察到的細胞豐度變化，我們分析了終末期小鼠的腫瘤裂解液中mTOR和自噬標記物(圖7b)。

與由兩種腫瘤細胞類型組成的未治療小鼠的腫瘤相比，cddp治療組的腫瘤表現出mTOR信號上調、LC3處理缺陷和p62降解(圖7b，左)，這與基于熒光腫瘤監測觀察到的cddp誘導的H460res細胞富集相一致。相比之下,DCA處理的小鼠腫瘤顯示減少的mTOR信號和減少的LC3水平和p62(圖7 b,右面板),符合DCA H460res細胞耗竭。

在H460par腫瘤中，mTOR信號在治療期間保持較低或下降，而在H460res腫瘤中，mTOR信號維持甚至上升(圖7c)。

最重要的是，在H460res腫瘤中，作為細胞凋亡標志物的cleaved - caspase-3在單次2DG或DCA處理后顯著上調(圖7c, d，補充圖6)。

單獨使用Phen時，雖然2DG/DCA的劑量降低到50%，但僅輕微增加了細胞凋亡，但卻大大增強了2DG/DCA的凋亡作用(圖7d)。