缺血/再灌注損傷(IRI)是急性腎損傷(AKI)的主要原因,與高發病率和高死亡率相關,缺乏專門的治療方法。在這項研究中,調查了人類尿液來源干細胞(hUSCs)及其外泌體對IRI誘導的AKI的保護作用,以探索這些細胞作為新治療策略的潛力。本文發表在Theranostics(IF:8.579)的2020年1021卷。
技術路線:
主要實驗結果:
1、分離鑒定hUSCs
如圖1所示,從人類尿液樣本中分離出細胞培養3-5天,觀察到微小的紡錘狀細胞集落,并能在體外迅速增殖,流式,WB和qRT-PCR檢測了其表面分子的表達,包括OCT4和NANOG。
圖1人類尿液來源干細胞的特性
2、在腎IRI模型中,USCs可減少腎小管損傷和細胞凋亡,抑制局部炎癥
與對照組相比,USC處理顯著提高大鼠生存期,注射USCs后第3天sCr和BUN水平降低,第7天腎臟損傷病理評分降低。
圖2 腎IRI后USCs對腎功能的保護作用
隨后,作者檢測了USC處理的IRI小鼠模型腎臟細胞的凋亡,和炎癥因子的表達情況,如圖3所示,USC處理后細胞凋亡顯著減少,炎癥細胞的浸潤顯著下降,細胞的氧化應激水平也明顯受到抑制。
圖3 USCs降低IRI后腎臟凋亡相關蛋白表達、炎癥細胞浸潤和氧化應激水平
3、USC-Exo在體內對IRI有保護作用,在體外對H/R損傷后的HK-2細胞氧化應激有抑制作用
為了探究USC處理對小鼠的保護作用是否通過外泌體發揮作用,作者從USC中提取了外泌體樣本,如圖4A所示。隨后發現,與對照組相比,USC來源外泌體(USC-Exo)處理組顯著提高了小鼠生存期,sCr和BUN水平降低。在體外H/R損傷后,使用USC-Exo處理組的HK2細胞的焦亡和炎癥分子的表達顯著下降,表明USC-Exo對HK2有保護作用。
圖4 USC-Exo在體內對腎功能有保護作用,在體外對H/R損傷后的HK2細胞有保護作用
4、在USC-Exo中,miR-146a-5p抑制IRAK1的表達
為了進一步探究USC-Exo的作用機制,作者進行了外泌體RNA測序,從而鑒定到20個候選的miRNA,其表達如圖5A所示,挑選表達豐度最高的6個做了qRT-PCR驗證,發現只有miR-146a-5p顯著高表達。隨后,進行了熒光素酶實驗,結果顯示miR-146a-5p與IRAK1具有物理結合作用。
圖5 USC-Exo含量的miRNA測序及miR-146a-5p的潛在靶點
5、在體內和體外USC增強miR-146a-5p的表達和抑制IRAK1表達和NF -κB p65亞基的核異位
為了進一步證實miR-146a-5p對于USC在IRI中的保護作用至關重要的假設,首先確定了USR治療的IRI大鼠腎臟組織中miR-146a-5p的表達水平。 qRT-PCR分析顯示,USC治療的IRI組的腎臟中miR-146a-5p表達上調(圖6A)。為了進一步確定USC分泌的miR-146a-5p是否通過外泌體遞送到受損的腎臟組織,在USC處理后第3天從大鼠收集血清樣品,提取外泌體,并檢測miR-146a-5p的表達水平。結果顯示與對照組比,外泌體miR-146a-5p在經USC治療的血清組中表達更高(圖6B)。FISH進一步證明了在受損的腎臟組織中miR-146a-5p表達的增加(圖6C)。IRAK1的mRNA(圖6A)和蛋白(圖6D)表達水平在USC治療的IRI大鼠的腎臟中被下調。USC-Exo處理可顯著上調miR-146a-5p表達并下調IRAK1在HK2處理細胞中的表達(圖6E)。與體內觀察結果一致,WB顯示,USC-Exo處理后IRAK1蛋白表達以及NF-κB p65亞基的核易位均降低(圖6F)。進一步在USC-Exo處理的細胞中對NF-κB p65進行了染色,發現在H / R后的對照HK2細胞中,NF-κB p65位于細胞核中。相反,在H / R后經USC-Exo處理的HK2細胞中,一些NF-κB p65保留在細胞質中,其核定位水平顯著降低(圖6G)。這些結果表明,USC對腎損傷的保護作用可能是通過外泌體miR-146a-5p介導的NF-κB信號下調而發生的。
圖6 USC或USC-Exo上調miR-146-5p表達抑制IRAK1和NF -κB信號體內和體外
6、針對H / R HK2細胞miR-146-5p抑制IRAK1表達式和NF -κB p65核易位
接下來在體外使用H / R誘導的損傷模型描述miR-146a-5p和IRAK1之間的調控關系。用miR-146a-5p轉染HK2細胞,并通過qRT-PCR證實了miR-146a-5p表達增加(圖7A)。轉染的細胞同時受到H / R損傷,qRT-PCR分析顯示miR-146a-5p導致IRAK1 mRNA表達顯著降低(圖7A)。此外,用miR-146a-5p可以減少氧化應激,增加SOD活性,并降低MDA含量(圖7B)。WB表明,miR-146a-5p導致IRAK1蛋白表達和NF-κB p65亞基核易位顯著降低(圖7C)。免疫熒光染色顯示miR-146a-5p可以減少NF-κB p65的核定位(圖7D)。而用miRNA抑制劑處理HK2細胞,發現抑制劑治療組IRAK1的表達水平高于對照組(圖7E)。 miR-146a-5p抑制劑可加重氧化應激,降低SOD活性,并增加MDA含量(圖7F-G)。這些結果共同表明,miR-146a-5p在H / R誘導的損傷中調控IRAK1表達和NF-κBp65亞基核易位中具有不可或缺的作用。
圖7 miR-146-5p減少氧化應激,抑制IRAK1,NF -κB信號在H/R-induced HK2細胞的損傷
總而言之,本文證明了USC通過抗氧化,抗炎和抗凋亡細胞保護作用之間的相互作用,在IRI大鼠模型中預防腎臟損傷。 此外,在體外使用H / R誘導的氧化應激細胞模型,確定了USC-Exo中的關鍵參與者miR-146a-5p,它通過下調IRAK1 /NF-κB信號傳導來介導細胞保護作用。這些發現為使用無創且經濟高效的USC或USC-Exo治療AKI提供了理論基礎。
參考文獻:
Li Xirui., Liao Jun., Su Xiaojun., Li Weiqiang., Bi Zirong., Wang Jiali., Su Qun., Huang Huiting., Wei Yongcheng., Gao Yifang., Li Jun., Liu Longshan., Wang Changxi.(2020). miR-146a-5pHuman urine-derived stem cells protect against renal ischemia/reperfusion injury in a rat model via exosomal which targets . Theranostics, 10(21), 9561-9578. doi:10.7150/thno.42153