美國哈佛大學Wendy S. Garrett課題組發現,飲食可通過翻譯后修飾影響小鼠腸道微生物蛋白質組,從而調節腎功能。相關論文于2020年9月18日發表在《科學》雜志上。
慢性腎病的發病機制和治療一直未得到充分的研究。許多飲食微生物組研究都集中在膳食纖維、脂肪和碳水化合物的影響上。雖然有5%到10%的氨基酸會到達結腸,而結腸是腸道細菌代謝的主要部位,但人們對飲食中蛋白質和氨基酸的具體作用知之甚少。在人類中,增加膳食蛋白會增加腸道細菌產生H2S、吲哚和吲哚硫酸鹽。在慢性腎臟病(CKD)小鼠模型中,研究人員發現高硫氨基酸飲食會導微生物色氨酸酶活性的致翻譯后修飾。這降低了小鼠產生尿毒癥毒素的活性并改善了CKD的進展。因此,飲食可以通過翻譯后修飾來調節微生物群的功能,從而促進健康的宿主生理,而無需改變微生物群落組成。
據了解,CKD與腸道菌群之間的關聯已被發現,但有關機制仍未解析。在人類中,飲食蛋白會增加腸道細菌產生H2S、吲哚和吲哚酚硫酸鹽的能力。后者是尿毒癥毒素,H2S具有多種生理功能,其中某些功能是由翻譯后修飾介導的。
技術路線:
一、飲食中的Saa和腸道菌群調節CKD小鼠腎臟損傷的嚴重程度
我們制定了等熱量的飲食來代表小鼠對含硫氨基酸(Saa)的極端消費,與人類的消費相關,即低含量的蛋氨酸和半胱氨酸(參見表S1的飲食配方、材料和方法),但有足夠的蛋氨酸,以避免蛋氨酸限制。
與小鼠相比high-Saa +adenine ,specific-pathogenfree (SPF)小鼠低Saa +腺嘌呤(Saa +adenine )飲食有明顯增加血清肌酐水平(圖1),以及更廣泛和嚴重的腎皮質組織病理變化,包括管狀擴張和輟學,和管周纖維化tubulitis,皮質晶體沉積(圖1,B, D)。為了確定Saa的影響在多大程度上依賴于腸道菌群,我們將Saa+Ade飼料喂給生養的無菌種(GF)小鼠。與低saa +Ade日糧喂養的SPF小鼠相比,GF小鼠的血清肌酐和腎臟損傷明顯降低,且GF小鼠和高saa +Ade日糧喂養的SPF小鼠具有相似的表型(圖1,A至D)。高Saa飼料的SPF小鼠盲腸硫化物含量高于低Saa飼料的小鼠(圖1,E和F)。不管Saa飼料如何,GF小鼠ceca的硫化物含量顯著低于SPF小鼠(圖1,E和F)。進一步分析PTRI全基因組測序數據集加強了這一發現,我們發現CKD患者樣本中標準化大腸桿菌平均基因豐度高于非CKD對照(圖1G)。
在低saa +Ade飲食中,ASF小鼠被大腸桿菌(ASFE)定植。與ASF小鼠相比,大腸桿菌(coli)血清肌酐水平更高,更廣泛的小管炎、管狀萎縮和水腫、管周纖維化和皮質結晶(圖1,H - K)。與SPF小鼠一樣,我們發現ASFE中盲腸硫化物含量更高。高、低saa +Ade飲食中的大腸桿菌小鼠(圖1、L和M)。
總之,這些結果支持大腸桿菌與飲食中的Saa相互作用來調節腎功能
二、對大腸桿菌S-sulfhydrome 的表征表明TnaA是一種高度S-sulfhydrome 的蛋白質
在lead acetate 檢測試驗中,無論喜氧或厭氧培養的大腸桿菌都能從半胱氨酸中以劑量依賴的方式產生硫化物,且不影響生長(圖2A和圖S4, a至C)。decR的缺失導致硫化物產量顯著下降,但對生長動力學沒有影響(圖2,A和B;圖S4, A至D)。pulldown利用馬來酰亞胺與游離硫醇和過硫化物結合,產生硫醚鍵,并利用二硫蘇糖醇(DTT)破壞二硫鍵而不破壞硫醚鍵的能力(圖2,C)。我們觀察到,在添加半胱氨酸的培養基中,dtt洗脫的野生型大腸桿菌裂解液樣品中,s巰基化蛋白得到了穩健的富集(圖2D)。相比之下,在添加半胱氨酸的LB肉湯中生長的產生較少H2S的DdecR細菌的裂解液比WT大腸桿菌表現出更少的s -巰基化(圖2E)。我們試圖使用定量串聯質量標簽(TMT)液相色譜多階段質量分光光度(LC-MS3)分析來鑒定大腸桿菌的磺氫。該分析顯示,與未處理DTT的相同樣品相比,大多數被DTT洗脫的大腸桿菌裂解液中富集的蛋白質確實是s -巰基化的(圖2F)。按q值對s -巰基化蛋白進行排序(DTT與非DTT),結果顯示了10個最豐富的s -巰基化蛋白(圖2F和圖S4G)。TnaA(圖2F),一種催化色氨酸降解為吲哚、丙酮酸和氨的分泌酶,提供了我們的s -巰基分析和我們在CKD小鼠模型中觀察到的表型之間的潛在聯系。
三、硫水合抑制吲哚產生的大腸桿菌酶活性
TnaA成為研究CKD小鼠模型中宿主微生物相互作用的一個有吸引力的目標。我們將大腸桿菌的TnaA染色體復制替換為在其本地啟動子下克隆的TnaA -his。然后,我們通過Western blot分析WT和DdecR E. coli裂解液中的TnaA s -巰基化反應,驗證了我們的s -巰基化結果,發現DdecR裂解液中的TnaA s -巰基化反應降低(圖3A)。H2O2和NaHS處理的大腸桿菌裂解液TnaA s -硫酸化反應分別減少和增加(圖3B)。細菌培養物LC-MS/MS分析。我們發現,向LB肉湯中添加半胱氨酸或NaHS可以降低上清液中的吲哚濃度(圖3,C和D)。我們觀察到,與多硫化物供體四硫化二鈉(Na2S4)孵育可導致TnaA s -巰基化(圖S6D)和體外酶活性降低60%(圖3E)。作為實驗對照,我們添加了DTT,可以將s -巰基化TnaA降低到其功能原生形態,我們觀察到TnaA活性增加了三倍以上(圖3E)。
總之,這些結果表明無論是在體外還是在細菌培養中,通過色氨酸產生吲哚來檢測大腸桿菌TnaA的硫酸水合作用降低了它的活性。
四、在小鼠CKD模型中,膳食Saa調節盲腸吲哚水平、血清吲哚酰硫酸鹽水平和腎功能
與低saa飲食的小鼠相比,高saa飲食的小鼠盲腸中TnaA s -巰基化含量更高(圖4A)。我們測量了兩種飲食下ASF大腸桿菌小鼠的盲腸內吲哚含量。我們發現,高Saa飲食的小鼠吲哚水平顯著降低,這表明,高Saa飲食不僅增加了TnaA s -巰基化,而且這種修飾足以影響體內TnaA的活性(圖4,B和C)。在大腸桿菌小鼠中,ASFtnaA mut小鼠的血清中未檢測到吲哚酰硫酸鹽,因為在腸道菌群中不存在色氨酸酶。由于大腸桿菌DdecR缺乏從半胱氨酸中生成硫化物,TnaA仍保持較少的硫化物化和較高的活性(圖S6A)。與觀察結果一致的是,ASFDdecR小鼠的盲腸硫化物減少(圖S7C),盲腸吲哚增多(圖S7D),血清吲哚基硫酸酯相對于ASFE增加。大腸桿菌小鼠(圖4D)。WT大腸桿菌定植的小鼠比tnaA mut菌株定植的小鼠血清肌酐水平更高(圖4E)。大腸桿菌DdecR與WT大腸桿菌相比,更嚴重的管間質損傷、纖維化、皮質晶體沉積和更廣泛的實質受累的組織學結果反映了吲哚酰硫酸鹽和肌酐觀察到的趨勢(圖4,F, G)。
總之,這些數據支持了飲食成分可以產生影響腸外宿主功能的腸道微生物蛋白的翻譯后修飾,也為宿主-飲食-微生物群的相互作用如何導致CKD等疾病狀態提供了機制上的見解。