lncRNA一般被認為是沒有編碼蛋白能力的RNA，但是近期研究證明非編碼RNA具有編碼蛋白的能力，并在腫瘤中發揮重要作用。今天來講一篇關于lncRNA通過編碼蛋白質促進結腸癌（CRC）進展的文章，題名為：Small Protein Hidden in lncRNA LOC90024 Promotes "Cancerous" RNA Splicing and Tumorigenesis，發表在Advanced Science期刊上，IF=15.84。

技術路線：

    作者首先使用了核糖體RIP對結合核糖體的RNA進行純化，并通過RNA測序技術分析顯示lncRNA LOC90024可以與核糖體結合，這表明LOC90024可能以lncRNA分子的形式翻譯為蛋白質/肽或參與翻譯調控。生物信息學分析表明，LOC90024中存在一個393個核苷酸的ORF，可能編碼130個氨基酸的小蛋白。將這種小蛋白命名為SRSP。同源性分析表明，SRSP在靈長類動物（中高度保守，但在SRSP中沒有經典的結構域，這表明SRSP是一種功能未知的新型蛋白質。為了確認lncRNA LOC90024中的預測ORF可以翻譯，將預測ORF中的起始密碼子ATG突變為ATT。突變后消除了SRSP-GFP或SRSP-Flag融合蛋白的表達。通過質譜進一步鑒定了SRSP-GFP蛋白。總的來說，這些數據表明lncRNA LOC90024實際上編碼一種小蛋白SRSP。

    天然的內源性SRSP存在于結直腸癌，乳腺癌，卵巢癌和鼻咽癌癌細胞中，結腸癌和癌旁組織存在天然的內源性SRSP。質譜鑒定并驗證了癌組織中天然內源產生的SRSP。綜上所述，這些數據表明，SRSP是人類細胞和組織內源性自然產生的。IHC）分析了101個CRC組織樣本和79個正常樣本（包括79對CRC組織及其匹配組織）中的SRSP表達水平。CRC組織中SRSP表達水平顯著高于相鄰的癌旁組織。高SRSP水平的CRC患者比低SRSP水平的CRC癌癥死亡風險更高。

    進一步研究LOC90024和SRSP在CRC腫瘤發生中的功能，使用CRISPR‐Cas9技術構建了LOC90024基因敲除（KO）細胞。LOC90024的 KO 可顯著抑制癌細胞的增殖，集落形成，遷移和侵襲。在LOC90024 KO細胞恢復了lncRNA表達，LOC90024 ORF和5'UTR-ORF構建體可促進癌細胞增殖，集落形成，遷移和侵襲，而LOC90024 5'UTR-ORFmut構建體不會改變CRC細胞的增殖，集落形成，遷移和侵襲。ORFmut標志 5'UTR-ORFmut-Flag表達的體內異種移植腫瘤生長與空白載體表達相似。這些數據表明，SRSP而非LOC90024 lncRNA本身可促進腫瘤發生。

    為了揭示SRSP促進腫瘤發生和癌癥進展的機制，通過蛋白組學分析尋找了SRSP的相互作用蛋白。質譜鑒定出總共574種SRSP相互作用蛋白。GO分析顯示，這些與SRSP相互作用的蛋白主要被歸類為RNA結合蛋白，這表明SRSP可能主要通過與剪接調節劑相互作用來調節RNA剪接。SRSF3是一種RNA剪接因子和RNA結合蛋白。實驗證實SRSP可以與SRSF3相互作用。進一步研究了SRSP是否通過RNA與SRSF3相互作用。在存在RNase處理的情況下，SRSP仍與SRSF3相互作用，表明SRSP與SRSF3的相互作用不依賴于RNA。
    SRSF家族蛋白在N端包含一個RRM以與RNA結合，在C端包含一個RS結構域以與其他伴侶蛋白結合。將C端和N端突變在HEK293T細胞中共表達。只有包含N末端的SRSF3才能與SRSP相互作用。為了確定SRSP的哪些區域或殘基與SRSF3相互作用，構建了一系列SRSP-Flag突變體，我們證明了SRSP（1–60 aa）的N末端與SRSF3相互作用。只有包含16-30個aa區域的SRSP才能與SRSF3相互作用，而該區域的脯氨酸-精氨酸-精氨酸（PRR）基序對于相互作用不是必需的，確認SRSP的16-22aa區域與SRSF3相互作用。4J）。因此，SRSP中的GQPCGSP氨基酸（16-22氨基酸區域）是其與SRSF3 N末端相互作用的原因。

    發現SRSP促進了TF Sp4外顯子3的摻入，從而促進了長Sp4剪接變體形成（L-Sp4），并抑制了沒有外顯子3的短Sp4剪接變體形成（-S-Sp4）-。 當敲除SRSP表達時，有靶向RNA測序證實了Sp4外顯子3的敲除。SRSF3結合位點的突變完全廢除了SRSF3與Sp4 E3（848–866）RNA探針的結合。 但是，SRSP本身并未直接結合這些Sp4外顯子3 RNA探針，這表明SRSP無法直接識別并結合Sp4外顯子3。進一步研究了SRSP對SRSF3與Sp4外顯子3結合的影響。 我們發現，當SRSF3結合位點在Sp4的外顯子3中發生突變時，SRSP的過表達顯著增強了SRSF3與Sp4的E3（848-866）的結合，但并未誘導SRSF3與Sp4的第4外顯子結合。此外，SRSF3與Sp4外顯子3的結合以SRSP劑量依賴性方式增加。

    鑒于SRSP增強了SRSF3對Sp4外顯子3的結合和識別，進一步研究了SRSP對Sp4 premRNA剪接的影響。 LOC90024的KO損害了Sp4外顯子3的包含，從而減少了L‐Sp4的形成并增強了S‐Sp4的形成。在LOC90024-KD細胞中獲得了相似的結果。 LOC90024 ORF和5′UTR‐ORF（5′U）（編碼SRSP）的過表達增加了L-Sp4的形成并減少了S-Sp4的形成，而LOC90024 5′UTR‐ORFmut（MUT）的過表達并沒有改變Sp4 premRNA的剪接。 我們用LOC90024 ORF，5'UTR-ORF（5'U）或5'UTR-ORFmut（MUT）載體在LOC90024 KO細胞中恢復了LOC90024的表達。 SRSP重新表達后，LOC90024 KO受損的Sp4外顯子3的內含物恢復到對照水平，但LOC90024 lncRNA沒有恢復。 此外，SRSP不會改變Sp4 mRNA的總水平。 SRSF3的KD減弱了SRSP過表達誘導的Sp4外顯子3增加的包涵性。臨床腫瘤組織樣本中研究了Sp4 pre-mRNA剪接。 與匹配的相鄰非腫瘤組織相比，腫瘤組織中的L‐Sp4 mRNA水平升高而S‐Sp4 mRNA水平降低。臨床組織樣品中L‐Sp4水平與SRSP水平呈正相關，而S‐Sp4水平與SRSP水平呈負相關。總體而言，SRSP促進了Sp4外顯子3的SRSF3依賴性包涵，以誘導L-p4形成并抑制S-Sp4形成。

    L-Sp4剪接變體編碼784-aa蛋白L-Sp4亞型，而不帶外顯子3的S-Sp4剪接變體由于幀偏移而編碼49-aa肽S-Sp4亞型。為了確定L-Sp4和S-Sp4在CRC腫瘤發生中的作用，我們恢復了Sp4-KD大腸癌細胞中抗Sp4 siRNA的L-Sp4或S-Sp4的表達。Sp4的KD可抑制HCT-116和SW480細胞的生長、集落形成、遷移和侵襲。在重新表達L-Sp4后，HCT-116和SW480 CRC細胞中Sp4的KD誘導的細胞生長、集落形成、遷移和侵襲的減少可以有效地恢復到控制水平，表明L-Sp4亞型具有致癌功能，而S-Sp4亞型沒有致癌作用功能。

    為了研究SRSP是否促進SRSF3與Sp4外顯子3的結合、Sp4外顯子3的包含以及通過與SRSF3的相互作用促進細胞的腫瘤發生，在LOC90024 KO細胞中恢復野生型SRSP或SRSF3結合缺陷SRSPΔ16–22突變體的表達。當SRSP中SRSP與SRSF3的結合區域被刪除時，SRSP沒有增加SRSF3與Sp4的E3（848–866）的結合。當SRSP中SRSP與SRSF3的結合區域被刪除時，SRSP沒有誘導Sp4第3外顯子的包含以促進L-Sp4剪接變體的形成。從功能上講，野生型SRSP的再表達有效地將LOC90024 KO誘導的細胞生長、菌落形成、遷移和侵襲的降低恢復到對照水平，而SRSF3結合缺陷SRSPΔ16–22突變體沒有。因此，這些結果表明，SRSP主要通過與SRSF3的相互作用促進Sp4剪接和腫瘤發生。