食管癌是全球第七大常見癌癥和第六大常見癌癥死亡原因。食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）約占全球食管癌病例的90%，其中50%以上的ESCC發(fā)生于中國。食管癌五年生存率在30%以下，主要是因?yàn)樵缙谠\斷的臨床方法有限以及診斷前腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)。目前，這些過程的分子機(jī)制仍不明確。近期，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的劉志華教授課題組通過TCGA數(shù)據(jù)庫選定了在食管癌組織中表達(dá)水平高的EIF3H分子，發(fā)現(xiàn)EIF3H能夠促進(jìn)ESCC的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移，且EIF3H可能是一種去泛素化酶，能穩(wěn)定Snail蛋白水平，且揭示了EIF3H-Snail信號軸在ESCC侵襲過程中的重要作用，并提供了EIF3H作為ESCC治療生物標(biāo)志物的證據(jù)。相關(guān)研究以“EIF3H promotes aggressiveness of esophageal squamous cell carcinoma by modulating Snail stability”為題發(fā)表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research雜志上，雜志影響因子7.068。
研究思路：

1. TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘在食管癌中高表達(dá)的基因，并在體內(nèi)外驗(yàn)證EIF3H在ESCC中高表達(dá)。

2. 探究EIF3H對ESCC發(fā)生、生長、遷移和侵襲的影響。

3. 確定EIF3H的下游靶標(biāo)（Snail）。

4. 探究EIF3H與Snail相互作用以及對ESCC的影響。

結(jié)果：
1.EIF3H在食管癌中的表達(dá)情況
    作者根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析了EIF3H在食管癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EIF3H在食管癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)（A），隨后對人食管上皮細(xì)胞和食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞系進(jìn)行免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)EIF3H在腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)（B），且免疫組化分析顯示ESCC組織中EIF3H的表達(dá)明顯高于鄰近的正常食管上皮組織（C，D）。綜上所述，這些結(jié)果表明EIF3H在ESCC中高表達(dá)。

2.EIF3H在體內(nèi)外對ESCC發(fā)生和生長的作用
    為了研究EIF3H在腫瘤進(jìn)展中的功能，作者使用EIF3H過表達(dá)或沉默的KYSE150和KYSE510細(xì)胞來探究EIF3H對細(xì)胞生長的影響，通過免疫印跡和RT-PCR檢測EIF3H在這些細(xì)胞中過表達(dá)或敲除的效果（A-D），發(fā)現(xiàn)EIF3H過表達(dá)引起KYSE150和KYSE510細(xì)胞的增殖增加（E，F(xiàn)），而EIF3H沉默顯著降低了細(xì)胞增殖（G，H）。此外，在體內(nèi)異種移植模型中注射EIF3H沉默的KYSE150細(xì)胞的小鼠腫瘤生長和Ki67陽性百分率顯著降低（I-J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明EIF3H在ESCC腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中對細(xì)胞增殖有重要作用。

3.EIF3H對ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型影響
    作者進(jìn)一步研究EIF3H對ESCC細(xì)胞遷移和侵襲的作用，通過transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EIF3H過表達(dá)能顯著增加KYSE150和KYSE510細(xì)胞遷移和侵襲能力（A，B），而EIF3H沉默削弱了這些能力（C，D）。肺轉(zhuǎn)移模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射EIF3H沉默細(xì)胞的小鼠肺組織中缺乏轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，肺重量明顯輕于對照組（E）。綜上所述，這些結(jié)果表明EIF3H沉默抑制了ESCC細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。

4.EIF3H與Snail相互作用
    通過co-IP和LCMS/MS檢測了與EIF3H相互作用的蛋白（A），由于Snail是EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，排名靠前，引起了作者的注意。為了證實(shí)EIF3H和Snai之間的相互作用，將EIF3H-flag和Snai共同表達(dá)在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行co-IP實(shí)驗(yàn)，免疫沉淀EIF3H后檢測到了Snail（B）且EIF3H和Sna-flag共同表達(dá)分析觀察到類似的結(jié)果（C）。KYSE510細(xì)胞的內(nèi)源性Snail免疫沉淀也證實(shí)了內(nèi)源性Snail與EIF3H之間的相互作用（D）。通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性EIF3H和Snail在 KYSE510細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)共定位（E），且在HEK293T細(xì)胞中Snail的6個(gè)截?cái)嗟耐蛔凅w或Snail全長與EIF3H共表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)缺失S-P結(jié)構(gòu)域的Snail突變體失去了與EIF3H相互作用的能力（F）。這些結(jié)果揭示了EIF3H與Snail之間的相互作用是通過Snail 的S-P結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。

5.EIF3H通過去泛素化穩(wěn)定Snail
    作者在HEK293T細(xì)胞中共同表達(dá)了Snail與EIF3H，發(fā)現(xiàn)EIF3H明顯上調(diào)了Snail蛋白，但對Snail mRNA水平?jīng)]有影響（A），采用CHX脈沖追蹤法檢測EIF3H通過阻斷蛋白合成對Snail穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EIF3H可以顯著穩(wěn)定Snail蛋白水平，而轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞中Snail蛋白明顯降解（B）。HEK293T細(xì)胞中EIF3H與Snail共同表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EIF3H可以消除Snail的泛素化（C），并延長了Snail的半衰期（D，E），而內(nèi)源性的Snail在 EIF3H沉默后變得不穩(wěn)定并加速降解（F，G），且內(nèi)源泛素化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EIF3H去泛素化內(nèi)源性Snail（H），而EIF3H的沉默促進(jìn)了內(nèi)源性Snail的泛素化（I）。這些結(jié)果表明EIF3H可能是一種新型的維持Snail蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶。

6.EIF3H在ESCC細(xì)胞中促進(jìn)Snail介導(dǎo)的EMT
    作者研究了過表達(dá)EIF3H細(xì)胞中Snail和EMT相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EIF3H表達(dá)增加了Snail蛋白水平，同時(shí)使上皮標(biāo)志物(E-cadherin)蛋白水平降低，間充質(zhì)標(biāo)志物(N-cadherin和Vimentin)蛋白水平升高（A），而EIF3H沉默細(xì)胞中抑制了Snail蛋白水平，上調(diào)了E-cadherin蛋白以及下調(diào)了N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)（B）。在KYSE150-EIF3H過表達(dá)或?qū)φ占?xì)胞中同時(shí)沉默Snail，發(fā)現(xiàn)能夠逆轉(zhuǎn)EIF3H對KYSE150細(xì)胞遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用（C），而Snail在缺失EIF3H的KYSE150細(xì)胞中異位表達(dá)極大地增加了遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量，幾乎抵消了EIF3H沉默的影響（D）。總的來說，這些結(jié)果表明EIF3H可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞中Snail介導(dǎo)的EMT。

7.ESCC中EIF3H與Snail水平呈正相關(guān)
    作者通過尾靜脈注射模型研究了EIF3H沉默的KYSE150細(xì)胞在肺組織的作用，發(fā)現(xiàn)EIF3H的下調(diào)抑制了體內(nèi)Snail和Snail介導(dǎo)的EMT開關(guān)的表達(dá)，且對照組肺組織中Ki67陽性腫瘤細(xì)胞百分比也略高于EIF3H沉默組（A），隨后通過包含73對ESCC組織的組織芯片檢測了EIF3H和Snail的臨床相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EIF3H的表達(dá)水平與ESCC組織樣本中Snail的表達(dá)水平呈正相關(guān)（B，C）。以上數(shù)據(jù)表明EIF3H是穩(wěn)定Snail和ESCC侵襲性必需的因子。

結(jié)論：
    本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EIF3H可促進(jìn)ESCC發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移。EIF3H可能是一種穩(wěn)定Snail蛋白水平的去泛素化酶，且與Snail表達(dá)水平呈正相關(guān)，表明了 EIF3H-Snail信號軸在ESCC腫瘤侵襲性中的重要作用，為ESCC治療提供了一個(gè)很有前途的生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：
Xiaobin Guo, Rui Zhu, Aiping Luo, et al. EIF3H promotes aggressiveness of esophageal squamous cell carcinoma by modulating Snail stability. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2020, 39(1): 175.