放射治療是非小細胞肺癌（NSCLC）的主要治療方法之一，然而固有的或后天的放射抗性限制了其療效。到目前為止，大多數研究只關注獲得性耐藥。NSCLC內在放射耐受的確切機制尚不清楚。一些研究表明上皮-間充質轉化（EMT）與NSCLC的放射抗性有關。然而，對于特異性miRNAs的異常表達是否同時引起EMT和放射抗性的研究還很少。因此，今天小編為大家帶來發表于影響因子為13.493的“Signal Transduction and Targeted Therapy”上的文章“miR-410 induces both epithelial–mesenchymal transition and radioresistance through activation of the PI3K/mTOR pathway in non-small cell lung cancer”，給大家詳細介紹miRNA在肺癌放療中的作用及機制。

    在本研究中，miR-410是一個重要的調節因子，通過靶向PTEN/PI3K/mTOR軸來增強NSCLC的EMT和放射抗性。研究結果提示miR-410誘導的EMT可能是增強抗輻射能力的重要因素。因此，miR-410可作為NSCLC放療的潛在生物標志物或治療靶點。
技術路線：

結果：
1.miR-410促進NSCLC細胞系的EMT
    為了了解miR-410在非小細胞肺癌細胞EMT和放射反應中的作用，我們首先評估了非小細胞肺癌細胞系（A549、H1299、PC9和SPC-A1）和非癌性支氣管上皮細胞系（HBE）中miR-410的內源性水平。miR-410在NSCLC細胞中的表達水平顯著高于HBE細胞，在A549和H1299細胞中的表達水平高于PC9和SPC-A1細胞（圖1a）。因此，建立了穩定的miR-410過表達的PC9和SPC-A1細胞系（圖1b），并且先前建立的穩定的miR-410敲除A549和H1299細胞系也被用于進一步探索miR-410對EMT和體外放射反應的影響。有趣的是，miR-410敲除后觀察到A549和H1299細胞從典型的紡錘狀形態到鵝卵石狀的形態變化，而miR-410的異位表達導致更多的PC9和SPC-A1細胞呈梭形（圖1c）。此外，A549-Inh和H1299-Inh細胞上皮標志物（E-cadherin）蛋白水平顯著升高，間充質標志物（N-cadherin、Vimentin和Slug）顯著降低。相反，miR-410過表達引起了相反的效果（圖1d）。E-鈣粘蛋白和波形蛋白的免疫熒光分析也顯示了類似的結果（圖1e）。綜上所述，miR-410的過表達可以促進NSCLC細胞的EMT過程。

2.miR-410增加NSCLC細胞的抗輻射性
    為了進一步評估miR-410對體外放射反應的影響，通過克隆存活試驗測定細胞的放射敏感性。我們的結果顯示A549-Inh和H1299-Inh細胞的放射抗性顯著降低，但在PC9miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中卻顯著增加（圖2a）。然后，我們通過檢測DSBs特異性標志物γ-H2AX的表達，進一步研究miR-410對輻射誘導的DNA雙鏈斷裂（DSBs）的影響。照射后4小時，A549-Inh和H1299-Inh細胞的γ-H2AX蛋白水平顯著高于PC9-miR-410和SPCA1-miR-410細胞（圖2b）。此外，免疫熒光檢測到的γ-H2AX病灶在NSCLC細胞中顯示出類似的結果（圖2c）。因此，數據顯示miR-410增加了NSCLC細胞的抗輻射性，并可能與增強DSB修復有關。

3.miR-410直接靶向PTEN在NSCLC細胞中的作用
    為了確定miR-410誘導的EMT過程和抗輻射性的機制，使用TargetScan、DIANA microT-CDS和miRanda來預測miR-410的靶點（圖3a）。所有三種算法預測的潛在靶點被提交給DAVID工具進行KEGG途徑分析。結果表明，PTEN是289個潛在靶點之一。此外，先前的研究表明PTEN與EMT和抗輻射性密切相關。此外，KEGG分析表明，預測的靶點參與了多種癌癥相關的途徑（圖3b）。其中，PI3K/Akt和mTOR信號通路已被證實與PTEN密切相關，這進一步表明PTEN可能是miR410的候選靶點。miR-410與PTEN的3’-UTR之間的直接相互作用隨后通過雙熒光素酶報告試驗（圖3c-e）得到證實。此外，在A549-Inh和H1299-Inh細胞中觀察到PTEN蛋白水平升高，而在PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中檢測到PTEN的表達降低（圖3f）。總的來說，這些結果證實了PTEN是miR-410的直接靶點，并且在NSCLC細胞中受到miR410的轉錄后調控。

4.miR-410通過激活PI3K/mTOR通路促進NSCLC細胞的EMT和放射抗性
      研究表明PI3K/mTOR信號通路的激活在調節NSCLC的EMT過程或放射敏感性中起著重要作用。因此，基于以上結果，我們檢測miR-410是否通過激活PI3K/mTOR信號通路發揮其生物學功能。值得注意的是，miR-410在PC9和SPC-A1細胞中的過表達顯著增加了磷酸化Akt和mTOR的水平，導致P70S6K和4E-BP1的磷酸化增強。相反，A549和H1299細胞中miR-410的敲除顯著降低磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（圖4a）。這些結果表明miR-410確實激活了NSCLC細胞的PI3K/mTOR通路。基于上述結果，miR-410過表達可促進EMT和體外抗輻射性，我們接下來研究了PI3K、Akt或mTOR通路的特異性阻斷對miR-410過表達PC9和SPCA1細胞的EMT和放射抗性的影響。首先確認不同劑量的PI3K抑制劑（LY294002）、Akt抑制劑（MK-2206）和mTOR抑制劑（雷帕霉素）的有效性（圖4b）。進一步結果顯示，特異性PI3K、Akt或mTOR抑制劑顯著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中N-cadherin、Vimentin和Slug的表達，而提高了E-cadherin的表達（圖4c）。此外，在PI3K、Akt或mTOR途徑的抑制下，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中γ-H2AX的蛋白質水平和核病灶顯著增加（圖4d，e）。類似地，用PI3K、Akt或mTOR抑制劑處理后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞的抗輻射性顯著降低（圖4f）。因此，這些數據表明miR-410通過激活PI3K/mTOR信號傳導促進了NSCLC細胞的EMT過程和抗輻射能力。

5.PTEN逆轉miR-410誘導的NSCLC細胞EMT和放射抗性的恢復
    我們進一步研究了PTEN是否是PI3K/mTOR激活的關鍵，從而導致miR-410在NSCLC細胞中的生物學功能。將PTEN表達質粒轉染293T細胞后，PTEN蛋白水平顯著增加（圖5a）。此外，#1sipten在293T細胞中表現出最顯著的PTEN mRNA降低（圖5b）。此外，進一步證實了pVax-PTEN和siPTEN分別在miR-410過表達或敲除的NSCLC細胞中的有效性（圖5c）。事實上，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中PTEN表達的恢復顯著抑制了N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Slug的表達，并增加了Ecadherin的表達（圖5d）。此外，PTEN表達的恢復顯著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞中磷酸化的Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（圖5e）。經PTEN修復后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細胞的γ-H2AX表達水平和放射敏感性顯著提高（圖5f-h）。相反，在A549-Inh和H1299-Inh細胞中轉染siPTEN會產生相反的效果（圖5d–g）。總之，這些數據表明PTEN在miR-410誘導的PI3K/mTOR通路的激活中起重要作用，從而增強了NSCLC細胞的EMT和放射抗性。

6.miR-410過表達可促進EMT和體內抗輻射性，并與PTEN/PI3K/mTOR軸有關
    為了確定miR-410過表達是否能促進EMT，將SPC-A1-miR-410細胞注入小鼠側腹，并使用先前建立的A549-Inh皮下腫瘤模型。與體外結果一致，在SPC-A1-miR-410腫瘤中，波形蛋白和Slug的染色顯著增加，而E-鈣粘蛋白顯著降低（圖6a）。E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Slug的蛋白質水平也顯示出相似的結果。在SPC-A1-miR410腫瘤組織中也觀察到磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的表達水平升高（圖6b）。值得注意的是，SPC-A1-miR-410組PTEN的蛋白水平和免疫組化染色均顯示出顯著的下調（圖6b，c）。相反，對A549-Inh腫瘤的研究顯示了相反的結果（圖6a-c）。因此，這些數據表明miR-410過表達可增強體內EMT過程，并與靶向PTEN同時激活PI3K/mTOR通路有關。
    此外，為了探討miR-410過表達對體內放射反應的影響，隨機給皮下腫瘤小鼠注射RT 或 mock RT。與SPC-A1-miR-NC腫瘤相比，SPC-A1-miR-410腫瘤具有更強的抗輻射能力，其生長延遲更短（圖6d）。此外，與放射治療的SPC-A1miR-NC腫瘤相比，放射治療的SPC-A1miR-410腫瘤的γ-H2AX蛋白水平顯著降低（圖6e）。總之，這些數據表明miR-410的過表達促進了體內DSB修復的增強，并且體內增強的抗輻射能力也與PTEN/PI3K/mTOR軸的激活有關。

7.miR-410高表達與非小細胞肺癌組織中EMT和PTEN低表達相關
    為了探討miR-410與EMT過程的臨床相關性，我們收集了62例NSCLC標本。然后，檢測miR-410和EMT標記的表達水平，并根據我們定義的標準對EMT表型進行分類（圖7a）。miR-410高和低表達組被鑒定。間質和EMT表型更可能在高miR-410表達的患者中發現（圖7b）。此外，80.65%的miR-410高表達標本顯示PTEN的低表達，58.06%的miR-410低表達標本顯示PTEN的高表達（圖7c，d）。最后，我們探討了PTEN的表達與EMT標記的相關性。值得注意的是，在360例肺腺癌（TCGA）和325例肺鱗癌（TCGA）中，PTEN蛋白水平與E-cadherin水平呈正相關（圖7e）。因此，這些數據初步表明miR-410與TCGA-NSCLC標本EMT過程呈正相關。

結論：
    我們發現miR-410通過靶向PTEN/PI3K/mTOR軸，在體外和體內均可誘導NSCLC-EMT和放射抗性，其增強與DNA損傷修復有關。此外，miR-410誘導的EMT可顯著增強NSCLC的抗輻射能力。對NSCLC標本的進一步研究也表明miR-410與EMT呈正相關。因此，miR-410可能作為NSCLC RT的潛在生物標志物或治療靶點，在抑制EMT相關惡性腫瘤的同時，可以提高治療效率。