內質網至核信號1 (IRE1A)是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者肝臟中被激活的未折疊蛋白反應的傳感器。肝細胞釋放的富含神經酰胺的炎性細胞外囊泡(EVs)會激活IRE1A。但是IRE1A激活后對NASH的功能與機制仍不清楚，本文旨在研究抑制IRE1A對飲食誘導的脂肪性肝炎小鼠炎性EVs釋放的影響。該文章于2020年6月20發表在Gastroenterology（IF:17.373）期刊上。
技術路線：

主要結果：
1、藥物抑制IRE1A可改善NASH
    NASH的人和飲食模型可以激活脂毒性內質網應激反應。脂毒性內質網應激激活IRE1A導致EV釋放，而膽固醇（FFC）飲食誘發的小鼠脂肪性肝炎與循環促炎EV的增加有關。因此，為了證明IRE1A激活誘導的EV釋放和肝臟炎癥之間的機制聯系，在FFC喂養的小鼠NASH模型中檢測了抑制IRE1A對EV釋放、肝臟損傷和炎癥的影響。如圖1A-C所示，FFC飲食引起的剪接Xbp1 mRNA豐度和循環EVs的增加在4μ8C處理的小鼠中顯著減弱。不僅如此，4μ8C處理的小鼠中肝炎性病灶，丙氨酸轉氨酶 (ALT)，巨噬細胞積累都顯著減少（圖1D-G）。
    巨噬細胞介導的炎癥在NASH中扮演著重要的作用。募集單核細胞來源的巨噬細胞在NASH中觀察到的無菌炎癥反應的主要特征。因此，進一步探究抑制IRE1A誘導的EV釋放是否影響單核細胞的募集。結果發現，4μ8C處理的小鼠中Cd68、Lgals3、Ly6c (圖1H-J)和Ly6c陽性的單核細胞來源巨噬細胞都顯著減少。與此一致的是，促炎因子TNF-α和IL1-β（圖1L-M）顯著降低而抗炎細胞因子IL10 (圖1N)保持不變。因此，上述表明抑制IRE1A誘導的EV釋放抑制炎癥進程。

圖1 藥物抑制IRE1A可抑制NASH

2、基因敲除IRE1A敲除可減弱NASH
    作者構建了IRE1A抑制的保肝作用的肝細胞特異性敲除的Ire1a（Ire1aΔhep）小鼠模型。結果發現，Ire1aΔhep小鼠中剪接Xbp1 mRNA豐度、循環中EV的含量、炎性病灶、ALT、巨噬細胞積聚及細胞死亡都顯著下降（圖2A-G）。巨噬細胞marker Cd68、Lgals3、Ly6c的表達及單核細胞來源的巨噬細胞數量（圖2H-I）也在Ire1aΔhep小鼠中顯著下降。此外，TNF-α和IL1-β依舊顯著降低而IL10也仍保持不變（圖2J-L）。因此，在肝細胞IRE1A抑制后NASH減弱與循環EV下降和肝臟單核細胞來源的巨噬細胞減少相關。

圖2 肝細胞特異性IRE1A敲除可減弱NASH

3、IRE1A誘導來源肝細胞EVs
    作者接下來探究IRE1A激活是否足以導致肝細胞EV釋放。C57BL/6J小鼠接受腺病毒表達IRE1A (AdIRE1A)或B-gal (ads -gal)的對照。結果發現，循環EV在AdIRE1A小鼠中顯著高于對照鼠，而這種增長可以被4μ8C減弱（圖3A-B）。此外，4μ8C處理顯著降低了剪切Xbp1 mRNA豐度（圖3C）。IRE1A刺激產生的EV與對照組來源的EV具有不同的大小和形態（圖3D）。而具有肝細胞標記物CYP2E1和ASGPR123的免疫電鏡進一步證實了循環EV來源于肝細胞（圖3E）。使用WB對分離得到的EV進行了表征，隨后實驗發現無論施用AdIRE1A或者AdB-gal，IRE1A轉導的小鼠體內EV的總體數量都會顯著增加（圖3H）。這種增加是由于肝細胞釋放EV導致的。總之，上述表明肝細胞源性EVs的釋放在IRE1A激活后顯著增加。

圖3 IRE1A誘導肝細胞釋放EVs

4、IRE1A刺激的EV吸收單核細胞來源的巨噬細胞進入肝臟
    作者接下來檢測了CyTOF激活IRE1A后肝內白細胞的細胞異質性，結果發現IRE1A刺激足以導致肝細胞來源的EV釋放以及增加單核細胞來源的巨噬細胞在肝臟中的數量。然后，作者分離得到IRE1A刺激EV，并通過尾靜脈注射至小鼠體內，結果這些EV幾乎全部都能被肝細胞接收（圖4A），并且隨之巨噬細胞的積累顯著增加，這與預期的結果一致（圖4B-D）。此外，血漿中細胞因子TNF-α, IL1β, and IL10的水平均沒有改變（圖4E-G），表明小鼠缺乏系統性炎癥，這結果支持EVs在肝微環境中募集單核細胞來源的巨噬細胞的作用。隨后，在體外證實IRE1A 刺激的EVs的趨化作用，結果顯示BMDM向IRE1A EV的遷移顯著增加（圖4H-J）。因此，上述數據表明，肝細胞來源的IRE1A EV足以吸引單核細胞來源的巨噬細胞進入肝臟。并且結合以上關于小鼠NASH模型中IRE1A抑制的數據，可以認為IRE1A激活通過刺激吸引單核細胞的EV的釋放在NASH中具有促炎作用。

圖4 IRE1A刺激的EV吸收單核細胞來源的巨噬細胞進入肝臟

5、IRE1A刺激的EV釋放是通過新神經酰胺合成的轉錄上調介導的
    此前的研究發現在分離的肝細胞中，脂毒性EV的釋放依賴于神經酰胺的從頭合成。因此，作者進一步探究了該通路對體內IRE1A刺激的EV生物合成的作用。如圖5A所示，檢測到該通路中有8種分子在IRE1A轉導的肝臟中富集，其中有6種在IRE1A刺激的EV中富集（圖5B）。

圖5 IRE1A誘導神經酰胺新生生物合成

6、從頭合成神經酰胺對IRE1A誘導的EV釋放是必要的
    神經酰胺的合成的限速步驟是SPT催化，為了進一步研究IRE1A對SPT的基因調控，重點研究了XBP1。在silico分析中，確定了在Sptlc1和Sptlc2的啟動子區域存在假定的XBP1結合位點(圖6A)。IRE1A的激活可誘導Sptlc1和Sptlc2 mRNA和蛋白的表達(圖6B,C)。染色質免疫沉淀分析揭示在IRE1A移植的小鼠肝臟中，Sptlc1和Sptlc2啟動子上的XBP1占用率顯著更高(圖6D,E)。ERdj4是一個典型的XBP1靶點，用于指示XBP1的激活(圖6F)。因此，作者證實了Sptlc1和Sptlc2在肝臟中的表達增加是一種IRE1A-XBP1依賴的方式并最終導致肝鞘脂類的增加。

圖6 IRE1A刺激的EV釋放是通過SPT的轉錄激活介導的

    考慮到IRE1A誘導的肝臟中神經酰胺合成的上調，作者認為抑制神經酰胺合成將阻止EV的釋放。通過給小鼠喂食肉豆蔻素，一種SPT的藥理學抑制劑(圖6G)來探討這個問題。通過串聯質譜可以觀察到肉豆蔻素處理小鼠的肝細胞中神經酰胺通路中的分子顯著下調，與肉豆蔻素誘導的抑制SPT介導神經酰胺從頭合成一致（圖6I）。肉豆蔻素處理抑制IRE1A刺激的EV釋放，并且EV中神經酰胺的含量也顯著下降（圖6J-K）。這些結果表明IRE1A刺激的EV釋放需要SPT介導的神經酰胺的從頭合成。
7、SPTLC1和XBP1豐度升高是人類NASH的特征

圖7人NASH中剪接的XBP1和SPTLC1升高

    前面的結果證實了NASH患者循環EV的增加。隨后，作者通過與正常對照相比，證明NASH受試者的人類肝臟樣本中剪接的XBP1和SPTLC1 mRNA的豐度有所增加（圖7），擴展了上述觀察結果。使用RNAscope，發現在NASH肝臟中XBP1變異體2 (spliced XBP1)(圖7A和B)和SPTLC1(圖7A-C)增加。進一步地，spliced XBP1和SPTLC1豐度具有顯著的共線性(圖7D-E)。最后，將血漿EVs計數與NASH和炎癥級別相關聯，證明EVs與NASH和炎癥均相關(圖7F-G)。以上結果表明，IRE1A-XBP1信號通路的激活、XBP1表達的轉錄靶點SPTLC1及其與NASH和EV計數的相關性，以及EV計數隨NASH炎癥程度的加重而增加。

    總之，在小鼠肝細胞中，激活的IRE1A通過XBP1促進絲氨酸棕櫚基轉移酶基因的轉錄，導致神經酰胺的生物合成和EV的釋放。EVs將單核細胞來源的巨噬細胞招募到肝臟，導致飲食誘導脂肪性肝炎小鼠的炎癥和損傷。NASH患者肝組織中XBP1、絲氨酸棕櫚基轉移酶和EV水平均升高。阻斷這一途徑可能有助于減少NASH患者的肝臟炎癥。

參考文獻：
Dasgupta Debanjali., Nakao Yasuhiko., Mauer Amy S., Thompson Jill M., Sehrawat Tejasav S., Liao Chieh-Yu., Krishnan Anuradha., Lucien Fabrice., Guo Qianqian., Liu Mengfei., Xue Fei., Fukushima Masanori., Katsumi Tomohiro., Bansal Aditya., Pandey Mukesh K., Maiers Jessica L., DeGrado Timothy., Ibrahim Samar H., Revzin Alexander., Pavelko Kevin D., Barry Michael A., Kaufman Randal J., Malhi Harmeet.(2020). IRE1A Stimulates Hepatocyte-derived Extracellular Vesicles That Promote Inflammation in Mice With Steatohepatitis. Gastroenterology, undefined(undefined), undefined. doi:10.1053/j.gastro.2020.06.031