自然殺傷細胞(NK)在天然抗腫瘤免疫反應中發揮重要作用。近年來，NK細胞功能障礙在包括肝癌在內的多種惡性腫瘤中得到證實。然而，NK細胞功能障礙在人HCC中的分子生物學機制尚不清楚。本文部分回答了該問題：HCC來源的外泌體通過誘導NK細胞上TIM-3的表達抑制IFN-γ和TNFα的產生。本文于2020年6月27日發表在《Molecular cancer》期刊上。
技術路線：

主要結果：
1、HCC組織中UHRF1相關circRNA的分析
    UHRF1通常在HCC進展中上調表達，此外，circRNA是pre-mRNAs的反向剪切產物且通常被認為是癌細胞中pre-mRNAs剪切的副產物。一般來說，circRNAs的水平通常與各自的mRNA水平一致，因此，作者檢測了UHRF1來源的14種circRNA的表達水平（Fig.1A），其中hsa_circ_0048677 (circUHRF1)的表達最豐富且在HCC中顯著上調（Fig.1B）。進一步地，作者發現circUHRF1的表達在癌中顯著高于癌旁組織，且circUHRF1高表達的病人具有更大的腫瘤體積，血液中NK細胞含量更低，更多的微血管入侵以及更差的預后（Fig.1C-I）。

圖1 circUHRF1在HCC組織中上調表達

2、HCC細胞以外泌體方式分泌circUHRF1
    前人的研究表明可以通過外泌體在細胞間運輸，因此，作者猜測circUHRF1可能被HCC細胞轉運至其它細胞，為了驗證這個猜想，作者從HCC細胞系上清中分離鑒定到外泌體（Fig.A-B）。結果發現circUHRF1在六種HCC細胞系和對應的外泌體中的表達趨勢一致，且HCCLM3和SMMC-7721細胞系及其外泌體中的表達顯著高于其它細胞系（Fig.C-D）。此外，檢測發現circUHRF1存在與血漿中，并且HCC病人中血漿外泌體circUHRF1顯著高于健康志愿者，接受腫瘤切除術的病人外泌體circUHRF1含量降低，腫瘤逃逸的病人外泌體circUHRF1含量升高，這些結果說明血漿外泌體circUHRF1主要有HCC細胞產生（Fig.E）。有趣的是，有免疫逃避機制的患者血漿外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血NK細胞比例降低（Fig.F）。這表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細胞相關免疫逃逸的關鍵分子決定因素。

圖2 circUHRF1的表達及特性

3、HCC細胞抑制NK細胞功能通過外泌體circUHRF1
    為了確定HCC細胞的外泌體circUHRF1是否誘導改變異種NK細胞，作者將6個健康供體的NK細胞和HCCLM3和SMMC-7721細胞系以對等比例共培養24小時，結果發現，與單獨培養NK細胞相比，共培養后細胞IFN-γ和TNFα的分泌顯著受損（Fig.3A-C）。此外，NK細胞和HCCLM3和SMMC-7721細胞系共培養后顯著增加了circUHRF1表達，但是這種增加被外泌體抑制劑GW4869抑制（Fig.3D-E）。不僅如此，加入外泌體抑制劑后NK細胞中IFN-γ和TNFα的分泌在是否與HCC細胞共培養的組間沒有表現出差異（Fig.3F-G）。此外，circUHRF1沉默后HCCLM3和SMMC-7721細胞外泌體中circUHRF1的表達顯著下降，而IFN-γ和TNFα的分泌顯著升高（Fig.3H-J）。上述結果表明HCC來源的外泌體circUHRF1損傷NK細胞的功能。

圖3 外泌體表達circUHRF1抑制NK細胞的功能

4、在NK細胞中，circUHRF1和miR-449c-5p相互降解
    作者進一步探究circUHRF1在NK-92細胞中可以結合miRNA，通過StarBase v3.0分析，預測到14個潛在的靶miRNAs。使用circUHRF1特異性和NC探針進行體內circUHRF1沉淀，然后檢測circUHRF1復合物中14個靶miRNAs的表達。實驗發現，復合物中顯著富集miR-449c-5p，而其它則少有富集（Fig.4A）。然后，在NK-92細胞中使用anti-AGO2抗體進行RIP實驗，結果發現circUHRF1和miR-449c-5p在anti-AGO2抗體中顯著富集，這些結果表明circUHRF1可能是miR-449c-5p和AGO2的結合平臺（Fig.4B）。為了進一步驗證這個結果，進行了生物素標記的miR-449c-5p的pulldown實驗，結果表明與NC相比，circUHRF1顯著富集（Fig.4C）。熒光素酶實驗結果顯示，與NC相比，miR-449c-5p顯著降低了野生型circUHRF1的熒光素酶活性，但對突變型的沒有影響（Fig.4D-E）。有趣的是，circUHRF1的表達水平可以被過表達miR-449c-5p顯著抑制，反過來，miR-449c-5p的表達也可以被過表達circUHRF1顯著抑制（Fig.4F-G）。這些結果表明circUHRF1和miR-449c-5p相互靶向結合。

圖4 circUHRF1抑制miR-449c-5p在NK細胞中的生物學功能

5、circUHRF1上調TIM-3的表達通過抑制miR-449c-5p活性
    通過上述實驗結果，作者猜測circUHRF1可能通過miR-449c-5p海綿上調其靶點的水平進而增強HCC病人的免疫逃逸。為了驗證這個猜想，作者首先分析了NK細胞中miR-449c-5p靶點的表達水平，包括TIM，然后使用熒光素酶實驗進一步驗證miR-449c-5p與TIM的結合（Fig.5A-B）。強制表達miR-449c-5p后，TIM的表達顯著下降（Fig.5C-D）。此外，circUHRF1的表達與miR-449c-5p的表達負相關，與TIM的表達呈正相關，miR-449c-5p的表達也與TIM的表達呈負相關（Fig.5E-G）。以上研究結果表明circUHRF1/miR-449c5p/TIM-3軸聯合作用影響NK細胞的功能。

圖5 在NK細胞中，circUHFR1調控miR-449c-5p/ TIM-3通路

6、circUHFR1以NK細胞依賴的方式誘導HCC的進展
    慢病毒載體pLO5-ciRcircUHRF1顯著提高了細胞和外泌體中circUHFR1的表達，以及NOD/SCID小鼠模型體內的肺轉移結節（Fig.6A-C）。此外，過表達circUHFR1具有肺轉移的小鼠體內血漿外泌體circUHFR1的含量顯著升高，而NKG2D陽性細胞數量顯著下降（Fig.6D-E）。這些結果表明circUHFR1以依賴外泌體和NK細胞的方式促進HCC進展。

圖6 circUHRF1以NK細胞依賴的方式誘導免疫逃逸

7、circUHRF1增強HCC對抗PD1治療的耐藥性
    鑒于強制表達circUHRF1抑制NK細胞的功能，所以接下來作者評估過表達circUHRF1是否會進一步阻礙anti-PD1的抗腫瘤作用。作者回顧性分析了30例在免疫治療前2-36個月行肝切除術并接受抗PD1免疫治療的復發遠處轉移(包括肺轉移)的HCC患者的資料。6個治療周期后，評估CT療效。結果發現3個病人表現部分響應（PR），7個病人表現穩定疾病（SD），20個病人表現進行性疾病。進一步研究發現circUHRF1的表達水平在PD組顯著高于SD組和PR組，而NKG2D陽性細胞數量在PD組顯著低于SD組和PR組，兩者呈現負相關性(Fig. 7A-C)。
    為了進一步評估circUHRF1對anti-PD1治療耐藥的影響，建立了皮下植入circUHRF1敲低的HCCLM3細胞或陰性對照細胞的異種移植模型。結果表明注射circUHRF1敲低的HCCLM3細胞導致小鼠對anti-PD1治療敏感且總體生存率升高(Fig. 7D-F)。這些結果表明強制表達circUHRF1可能妨礙HCC對anti-PD1治療的響應，靶向circUHRF1可能是恢復HCC對anti-PD1治療敏感性的有效方法。

圖7 在HCC患者中，高水平的circUHRF1與anti-PD1治療的耐藥性相關

    總之，本文證明HCC來源的外泌體通過誘導NK細胞上TIM-3的表達抑制IFN-γ和TNFα的產生。還報道了腫瘤外泌體通過外泌體circUHRF1抑制NK細胞功能的新機制，為HCC細胞和NK細胞的相互干擾提供了新的證據。
參考文獻：
Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5