CRC（結直腸癌）是一種惡性的實體腫瘤，抑制血管生成(主要通過阻斷VEGF(血管內皮生長因子)家族及其相應受體)已被證實可延長包括CRC在內的患者的總體生存期。VEGFA被認為是最重要的腫瘤細胞分泌促血管生成因子之一。進一步研究CRC中VEGFA異常上調的機制，可能為轉移性CRC治療提供新的策略。
        基因表達受到一些circRNAs的調控，這些circRNAs充當ceRNAs(競爭性內源性RNA)，也被認為是miRNAs的海綿，影響miRNAs的活性。circRNAs阻止miRNAs調控其靶基因。基于以上研究背景，中南大學Chen Chen等人在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research雜志（IF=7.06）發表文章探究circRNAs通過調節VEGFA對結直腸癌的影響。

技術路線：

研究結果：
1.選擇circ-001971
        文章首先根據以往的文獻報道篩選出11個在CRC腫瘤組織中高表達的circRNAs，然后利用RT-PCR檢測這11個circRNAs在腫瘤組織和正常組織中表達差異最大的，發現有3個circRNAs表達差異較大，其中circ-001971差異最大。之后，進一步在70個組織樣本中檢測，發現circ-001971在正常和腫瘤組織中表現出差異。COX回歸實驗發現circ-001971的表達與腫瘤分期和淋巴結轉移有關，低表達的circ-001971顯示出更高的總體生存率，ROC曲線顯示circ-001971具有潛在的診斷和預后能力。

2. circ-001971對CRC細胞增殖、侵襲和HUVEC血管生成的影響
        實驗中選擇了5中CRC細胞系(HT29, HCT116, LoVo, SW480和 SW620)和正常細胞系FHC，同在組織中的結果一樣，circ-001971在腫瘤組織中的表達比正常組織中多，尤其是HCT116和SW620細胞。之后，篩選出合適的沉默circ-001971的序列并在沉默circ-001971的細胞中檢測，發現沉默的細胞中DNA的合成能力、細胞活力和細胞的侵襲都顯著降低。最后，收集沉默和對照細胞中的細胞上清，并用來孵育HUVEC細胞，發現circ-001971低表達降低HUVEC管腔形成能力。

3.在體內實驗中，circ-001971對CRC生長的影響
        研究中采用慢病毒敲低circ-001971，6只小鼠平均分為2組，皮下注射SW620細胞轉染沉默circ-001971或對照的慢病毒載體，結果顯示，circ-001971敲低之后顯著降低腫瘤的體積和腫瘤的重量。以上結果表明在體內實驗中，circ-001971敲低抑制CRC腫瘤的生長。

4. 選擇并驗證與circ-001971和CRC血管生成有關的miRNA
        研究顯示circRNAs作為miRNA的海綿來減輕miRNA對下游靶基因的抑制。GSE126093和TargetScan預測miR-29c-3p, miR-497-5p, and miR-943靶向circ-001971。之后，為了找到與circ-001971、CRC血管生成有關的miRNA，實驗在2種細胞中過表達3種miRNAs并發現3中miRNAs過表達時circ-001971和VEGFA的表達降低并且miR-29c-3p能顯著抑制circ-001971的表達。之后，在細胞中抑制miR-29c-3p，circ-001971表達上調；抑制circ-001971，miR-29c-3p表達上調說明兩者的相互調節關系。而且，miR-29c-3p過表達顯著降低VEGFA的蛋白水平，miR-29c-3p抑制時升高VEGFA的蛋白水平說明兩者的調控關系。

5. MiRNA-29與circ-001971和VEGFA直接結合
        實驗中采用熒光素酶報告實驗驗證miR-29c-3p結合circ-001971 和 VEGFA。并進一步用RIP實驗驗證，結果顯示結果顯示circ-001971、VEGFA、miR-29c- 3p與AGO2相關; 這些數據證實circ-001971和VEGFA結合miR-29c-3p以AGO2相關的方式。

6.circRNA/miR-29-3p信號調節HUVECs的管腔形成能力
        在兩種細胞系中， miR-29c-3p抑制時增強VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，敲低circ-001971降低VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，而抑制miR-29c-3p逆轉了circ-001971對VEGFA蛋白表達和管腔形成能力的影響（理解：挽救實驗）。這些結果表明.circRNA/miR-29-3p軸調節VEGFA蛋白水平和HUVECs的管腔形成能力。

7.組織樣本中miR-29c、 VEGFA的表達及其與circ- 001971的相關性
        腫瘤組織中，PCR結果顯示miR- 29c-3p的表達降低而VEGFA的表達增強。WB和IHC結果顯示腫瘤組織中VEGFA表達增強。另外，miR-29c-3p與circ- 001971和VEGFA呈負相關，而circ-001971與VEGFA呈正相關。

總 結：
1.腫瘤組織中，VEGFA表達上調，而 miR-29c-3p表達下調。
2. miR-29c-3p與circ-001971、VEGFA呈負相關關系，而circ-001971 和VEGFA呈正相關關系。
3. circ-001971/miR-29c-3p通過VEGFA調節CRC增殖、侵襲和血管生成。
4.為研究circRNA-miRNA-mRNA網絡對CRC的影響提供了新的理論基礎。

參考文獻：
Chen C , Huang Z , Mo X , et al. The circular RNA 001971/miR-29c-3p axis modulates colorectal cancer growth, metastasis, and angiogenesis through VEGFA [J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2020, 39(1).