特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種致命的、無法治愈的肺間質(zhì)疾病，持續(xù)損傷可導(dǎo)致瘢痕組織形成。隨著纖維化變厚，肺組織失去了促進(jìn)氣體交換和為細(xì)胞提供所需氧氣的能力。目前，除了肺移植外，IPF幾乎沒有治療選擇，也沒有有效的治療方法。在這里，作者提出了利用肺球狀細(xì)胞分泌體(LSC-Sec)和外泌體(LSC-Exo)吸入來治療不同模型的肺損傷和纖維化。本文于2020年2月發(fā)表在Nature Communication（IF：11.878）雜志上。
結(jié) 果：
1、細(xì)胞分泌體減輕博萊霉素（Bleo）誘導(dǎo)的纖維化和凋亡
    小鼠PF模型中肺部炎癥通常持續(xù)7天，并在第9天進(jìn)入纖維化階段，因此，作者在第10天開始干預(yù)，以保證治療處于PF疾病階段（Fig. 1a）。在首次組織學(xué)檢查后，所有接受Bleo處理組均表現(xiàn)出出血性壞死（Fig. 1b）， LSC-Sec或MSC-Sec處理均可減少壞死。由于Bleo誘導(dǎo)DNA損傷，檢測了細(xì)胞分泌體處理對細(xì)胞凋亡的影響（Fig. 1c-f）。與PBS組相比，LSC-Sec治療導(dǎo)致肺細(xì)胞凋亡減少（Fig. 1d-f）。LSC-Sec和MSC-Sec處理均通過保留肺泡上皮結(jié)構(gòu)（Fig. 1g–h）和減少膠原沉積（Fig. 1i–k）來減少纖維化。只有LSC-Sec能夠減少纖維化面積并將肺泡上皮損傷恢復(fù)到健康水平(sham對照組)。

圖1 LSC-Sec吸入逆轉(zhuǎn)博萊霉素誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷

2、分泌體吸入促進(jìn)血管和肺泡修復(fù)
    肺泡是遠(yuǎn)端氣道的末端結(jié)構(gòu)。肺泡上皮由肺泡1型上皮細(xì)胞(AT1)和肺泡2型上皮細(xì)胞(AT2)組成，前者介導(dǎo)氣體交換，后者產(chǎn)生和釋放肺表面活性劑、抗氧化劑、細(xì)胞因子/趨化因子和其他對肺防御、損傷反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)重要的分子。因此，檢測了分泌體處理后Bleo損傷時AT1和AT2分布的變化，以評估上皮損傷和挽救（Fig. 2a）。AT1標(biāo)記水通道蛋白5（AQP5）的免疫染色顯示LSC-Sec處理能夠逆轉(zhuǎn)由Bleo引起的上皮損傷（Fig. 2a-d）。 但是，與PBS處理組相比，在LSC-Sec處理組中肺蛋白溶解產(chǎn)物的免疫印跡顯示AQP5蛋白顯著增加（Fig. 2e, f）。 此外，LSC-Sec處理顯著提高了表面活性蛋白C（ProSPC +）陽性AT2細(xì)胞的增殖（Fig. 2a-c），該細(xì)胞增殖并分化為AT1細(xì)胞。這種現(xiàn)象在MSC-Sec處理中仍然發(fā)生，但程度較低，與PBS組無顯著差異。只有LSC-Sec處理能夠增加PF肺中von Willebrand因子（vWF +）陽性脈管系統(tǒng)的表達(dá)（Fig. 2a, b）。與PBS組相比，在分泌體處理組中，ProSPC和vWF肺蛋白水平的免疫印跡顯示增加的趨勢（Fig. 2e, f）。
    同時，通過測量α-平滑肌肌動蛋白（αSMA，指示IPF的成肌纖維細(xì)胞標(biāo)志物）的蛋白質(zhì)水平來檢查纖維化反應(yīng)（Fig. 2e, f）。與PBS處理的對照組相比，LSC分泌體處理組αSMA表達(dá)下降。與PBS組相比，兩個分泌組中肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2的蛋白表達(dá)均呈增加趨勢。采用細(xì)胞因子陣列來探究全身細(xì)胞因子表達(dá)，作為免疫原性的量度。有趣的是，與PBS對照相比，LSCSec的促炎性IL-4表達(dá)呈下降趨勢（Fig. 2g, h）。IL-4是呼吸道疾病（例如哮喘）中促炎功能的重要介質(zhì)。

圖2 LSC-Sec吸入處理促進(jìn)肺泡修復(fù)

3、LSC分泌體治療二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化
    為了評估LSC-Sec的再生作用可以被應(yīng)用于其他的肺損傷模型，使用二氧化硅誘導(dǎo)肺纖維化。與之前的Bleo研究一樣，使用噴霧器連續(xù)7天給予可吸入細(xì)胞分泌體或生理鹽水（Fig. 3a）。在所有處理組，對凋亡細(xì)胞的影響均無顯著差異（Fig. 3b）。但是，與PBS處理組相比，LSC-Sec能夠顯著降低纖維化的嚴(yán)重程度（Fig. 3c, d）。二氧化硅誘導(dǎo)的結(jié)節(jié)周圍的纖維化組織強(qiáng)度較小且分布較廣，但在LSC-Sec和MSC-Sec處理組中均持續(xù)存在（Fig. 3c-f）。 與PBS處理相比，細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組處理減少了膠原蛋白沉積并減少了肺泡上皮損傷，盡管膠原蛋白沉積仍顯著高于健康假對照組（Fig. 3f, g）。
    對AQP5 + AT1細(xì)胞和ProSPC + AT2細(xì)胞的檢查顯示，在所有二氧化硅損傷的肺中，兩種肺泡標(biāo)記物均無明顯下降（Fig. 3h-j）。但是，與PBS組相比，LSC-Sec能夠通過促進(jìn)ProSPC + AT2細(xì)胞表達(dá)并維持AQP5 + AT1細(xì)胞群體來減少肺泡上皮損傷。表達(dá)AQP5的AT1細(xì)胞不存在纖維化結(jié)節(jié)，但ProSPC +和vWF +細(xì)胞的表達(dá)仍然有限（Fig. 3h-k）。

圖3二氧化硅損傷后小鼠肺的修復(fù)和纖維化

4、LSC分泌體和外泌體的蛋白質(zhì)組成
    為了更好的了解上述觀察到的LSC-Sec的再生能力的分子過程，作者嘗試構(gòu)建它的蛋白組的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然這三株LSC細(xì)胞系來自不同性別、種族和年齡的個體(圖4a)，但卻具有非常相似的蛋白質(zhì)組（Fig. 4a）。在共享的蛋白中，29.6%被標(biāo)注為具有已知分泌膜受體的胞外蛋白，47.5%被標(biāo)注為不存在已知分泌途徑的胞質(zhì)蛋白（Fig. 4b）。在三個LSC-Sec中鑒定的103個細(xì)胞外蛋白中，有20個的相對豐度較高（Fig. 4c）。此外，在LSC-Sec中發(fā)現(xiàn)的102種常見細(xì)胞外蛋白中，約有一半也在LSC-Exo中發(fā)現(xiàn)（Fig. 4e）。Fig. 4d和Fig. 4f分別是LSC-Sec和LSC-Exo中鑒定的胞外蛋白的GO分析。

圖4 LSC-Sec和LSC-Exo的蛋白組分析

5、LSC外泌體的治療作用
    通過大小、形態(tài)和常見的外泌體標(biāo)記(CD63、CD81和TSG101)對LSC-Exo和MSC-Exo進(jìn)行了表征（Fig. 5a-c）。所有分泌體和外泌體處理組均在維持正常肺結(jié)構(gòu)（Fig. 5e-f）和減少纖維化（Fig. 5h）、肺凋亡和膠原沉積（Fig. 5j-i）方面均顯示出治療效果。值得注意的是，與PBS處理組相比，只有LSC-Sec和LSC-Exo顯著降低了膠原沉積。此外，只有LSC-Sec可顯著降低纖維化(Ashcroft評分)至與sham對照組相似的水平。治療組的肺αSMA蛋白含量沒表現(xiàn)明顯下降的趨勢（Fig. 5j）。LSC-Sec和LSC-Exo處理減緩了肺泡上皮和血管損傷，并降低纖維化反應(yīng)，表現(xiàn)為AQP5 +和vWF +細(xì)胞增加和αSMA +細(xì)胞減少（Fig. 5k-n）。

圖5外泌體吸入處理肺纖維化大鼠的治療潛力

6、外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的肺功能
    作者檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2和MCP- 1的表達(dá)顯著響應(yīng)LSC-Sec和LSC-Exo治療（Fig. 6a）。接下來，預(yù)測LSC-Sec和LSC-Exo治療受損肺結(jié)構(gòu)和纖維化的臨床影響（Fig. 6b）。與預(yù)期一樣，吸氣量(IC)、阻力(Rrs)、順應(yīng)性(Crs)、遲滯面積、用力呼氣容積(FEV)與用力肺活量(FVC)之比較基線均下降了（Fig. 6c-e, g, h），且呼吸彈性(Ers)，順應(yīng)性的倒數(shù)，在中點分析時增加（Fig. 6f）。總之，所有Bleo動物的肺功能持續(xù)受損，如預(yù)期的那樣，肺損傷，導(dǎo)致組織硬度和彈性反沖增加。
    在終點分析中，通過分泌體和外泌體治療后僅部分恢復(fù)了肺功能。LSC-Sec，LSC-Exo或MSC-Exo治療后，吸氣能力和呼吸順應(yīng)性均顯著改善（Fig. 6c-e）。僅使用LSC-Exo治療，呼吸阻力有明顯恢復(fù)（Fig. 6d）。治療后彈性，滯后面積和FEV / FVC比均無明顯變化。

圖6外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的肺功能和外泌體miRNA分析

7、LSC和MSC外泌體的microRNA分析
    對LSC-Exo和MSC-Exo進(jìn)行了小RNA深度測序，并分析了它們的miRNA組成的差異。在這些LSC-Exo和MSC-Exo樣本中，總共檢測到超過600種獨特的miRNA，這表明外源性miRNA在這些樣本中可能具有多種調(diào)控作用。除去豐度較少的miRNA后，仍有142個miRNA用于進(jìn)行下游分析（Fig. 6i, j）。在兩種外泌體類型中總共發(fā)現(xiàn)42個差異表達(dá)的miRNAs。LSC-Exo中上調(diào)最多的miRNAs是hsa-miR- 99a-5p和hsa-miR-100-5p（Fig. 6j）。它們也是LSC-Exo中含量最高的兩個miRNAs，屬于miR-99家族（Fig. 6k）。

圖7外泌體治療改善Bleo誘導(dǎo)后的外泌體miRNA分析

    總而言之，本文報告了新型脫細(xì)胞治療劑，即LSC-Sec和LSC-Exo，在嚙齒動物中博萊霉素誘導(dǎo)和二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化治療中被證明是安全有效的。本文證明，LSC-Sec介導(dǎo)的再生機(jī)制可能與外泌體，MMP-2活性以及細(xì)胞分泌物中發(fā)現(xiàn)的大量蛋白質(zhì)有關(guān)。分泌體和外泌體的免疫原性遠(yuǎn)低于其親本，并且這些因子的施用可以克服干細(xì)胞的局限性，同時保持相似的治療效果。在LSC-Sec中對miR-30a和miR-99和let-7家族的miRNA的鑒定值得進(jìn)一步研究，因為已知miR-30a在IPF患者以及miR-99和let-7家族中被下調(diào)。IPF目前是一種不可治愈的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率和死亡率均在上升，目前沒有有效的療法，LSC-Sec和LSC-Exo為IPF療法的發(fā)展提供了新的希望。