膠質母細胞瘤干細胞（GSCs）是膠質母細胞瘤（GBM）細胞的一個亞群，對腫瘤的侵襲和抗腫瘤治療具有重要意義。然而，對TRIM24在GSCs中的作用和機制知之甚少。今天小編為大家帶來發表于“Neuro-Oncology”的文章“TRIM24 Promotes Stemness and Invasiveness of Glioblastoma Cells via Activating SOX2 Expression”，為大家詳細介紹TRIM24在膠質母細胞瘤細胞中的作用。

    在本研究中，我們發現TRIM24與CD133和Nestin在GBM組織和腫瘤球細胞中共表達。限制性稀釋試驗和異種移植實驗表明，TRIM24表達的下調降低了GSC的自我更新能力和侵襲性生長。TRIM24表達水平與瘤周T2WI異常體積呈正相關。拯救實驗表明TRIM24參與了GBM的滲透傳播。染色質免疫沉淀、報告基因分析、PCR、Western blot和免疫組化結果顯示TRIM24在體內外均能激活SOX2的表達，調節GBM的干細胞和侵襲。最后，通過檢測我們研究的樣本和探索外部數據庫，驗證了TRIM24和SOX2之間的密切關系。
結 果：
1.TRIM24富集于GSCs中
    由于GSCs優先位于血管周圍，為了評估TRIM24與GSCs之間的關系，我們用TRIM24抗體和內皮標志物CD31標記GBM手術標本。免疫熒光分析顯示血管周圍部分GBM細胞有較強的TRIM24染色。此外，TRIM24通常與干細胞標記物共表達，包括CD133和Nestin（圖1A）。流式細胞術分析證實TRIM24和CD133在一部分GBM細胞中重疊表達（圖1B）。接著為了評估TRIM24表達與腫瘤球形成能力間的關系，我們在干細胞允許培養基中培養了GBM細胞。TRIM24低表達的腫瘤細胞不能增殖，而TRIM24高表達的腫瘤細胞至少能增殖5代（圖1C）。另外，TRIM24，CD133和Nestin在腫瘤球細胞中共表達（圖1D）。Western-blot分析顯示FACS分類的CD133+細胞與CD133-細胞相比具有高的TRIM24表達（圖1E）。此外，與GBM細胞系和正常星形膠質細胞相比，GSCs和NSCs中內源性TRIM24水平明顯升高（圖1F）。

2.TRIM24對膠質母細胞瘤細胞的生長至關重要
    鑒于TRIM24在具有GSC特性的GBM細胞中富集，我們推測TRIM24可能促進GSC的維持。限制性稀釋試驗表明，TRIM24表達的降低顯著地抑制了GSCs的腫瘤球形成能力（圖2A）。來自新鮮手術標本的原代分離GBM細胞中TRIM24的敲除降低了CD133+亞群（圖2B）。另一方面，與對照組相比，TRIM24的過表達增加了GBM-19腫瘤球細胞的成球能力和原代分離GBM-19細胞的CD133+亞群（圖2C）。此外，TRIM24基因敲除導致的腫瘤球形成能力的損傷可以通過重新導入抗shRNA的TRIM24-WT來恢復（圖2D）。為了進一步探討TRIM24在體內的功能，我們將不同處理的GSCs移植到裸鼠腦中。與非靶向對照組相比，TRIM24基因敲除抑制了腫瘤的形成，大大延長了動物存活時間（圖2E）。

3.TRIM24通過驅動SOX2表達影響GBM干性
    我們進行了RNA測序和實時RT-PCR分析，并著重研究了GBM增殖所必需的可能調節因子。我們發現，TRIM24敲除后SOX2的轉錄水平顯著下調（圖3A）。雙熒光分析顯示TRIM24基因敲除顯著降低了SOX2啟動子報告子的相對熒光素酶活性（圖3B）。此外，芯片分析顯示TRIM24-WT與SOX2啟動子結合，而TRIM24突變體沒有（圖3C和D）。此外，該結合被TRIM24缺失或FBS誘導分化下調（圖3D）。功能分析顯示在缺失TRIM24后，體外腫瘤球形成能力和體內腫瘤形成能力的降低可以通過再次引入SOX2來挽救（圖3E）。這些結果提示TRIM24激活SOX2表達，調節GSCs的自我更新和腫瘤形成。免疫組織化學分析表明，對照組GSCs浸潤到小鼠腦實質和白質束。有趣的是，TRIM24下調的腫瘤細胞形成了邊界清楚的橢圓形移植物（圖3F）。

4.TRIM24表達水平與T2加權MRI異常相關
    鑒于廣泛的侵襲性生長是GBM患者預后不良的重要因素，并且TRIM24影響異種移植的組織學特征，我們試圖將TRIM24的表達水平置于臨床背景中。結果顯示高TRIM24表達的GBM患者與低表達的患者相比，腫瘤周圍T2WI異常體積更大（圖4A和B）。TRIM24的表達與腫瘤體積之間也存在顯著相關性（圖4C）。此外，通過測量最大擴展，也觀察到了類似的結果（圖4D和E）。

5.TRIM24通過SOX2促進GBM的體內外侵襲性
    TRIM24在高侵襲性GBMs中的過表達促使我們深入研究TRIM24對細胞遷移和侵襲的影響。愈合試驗表明，TRIM24基因敲除抑制了大量GBM細胞的遷移，TRIM24基因上調增強了GBM細胞的遷移。Transwell分析表明，TRIM24的敲除導致原代分離的GBM培養物和成熟的GBM細胞系的侵襲減少（圖5A和B）。另一方面，上調TRIM24的表達增加了GBM細胞的侵襲能力（圖5C）。接下來，我們將不同感染細胞原位移植到裸鼠體內。在攜帶TRIM24上調細胞的小鼠中，神經癥狀出現的潛伏期顯著縮短（圖6A）。異種移植切片的免疫組化分析表明，TRIM24的過表達增加了GBM細胞的滲透性傳播（圖6B）。Transwell分析顯示，通過重新引入SOX2或TRIM24-WT（圖5B），可以挽救TRIM24基因敲除后GBM細胞侵襲力的下降。同樣，在TRIM24基因敲除后，GSC腫瘤球細胞的侵襲性降低，可以通過重新導入SOX2或TRIM24-WT，但不通過TRIM24突變體。另一方面，在體外和體內，SOX2沉默抑制了TRIM24上調細胞的侵襲性表型（圖5C；圖6B）。

6.TRIM24-SOX2相關性存在于臨床環境中
    為了進一步探討TRIM24和SOX2在臨床中的關系，我們評估了它們在手術標本中的表達水平。Western blot分析顯示TRIM24和SOX2蛋白水平之間存在顯著相關性（圖6C）。通過使用RT-qPCR分析和探索外部數據庫（圖6D和E），發現它們在轉錄水平上的緊密聯系也很明顯。此外，免疫熒光分析顯示TRIM24和SOX2染色在腫瘤切片中強烈重疊，進一步證實了它們在GBMs中的密切相關性。

結 論：
    TRIM24在GSCs中特別富集，并調控GSC的特性。此外，臨床和實驗數據建立了TRIM24在腫瘤干細胞中激活SOX2表達的新的功能機制。這些發現表明，TRIM24是GBM治療的一個有吸引力的治療靶點。