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缺氧誘導(dǎo)的lncRNA-AC020978促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和糖酵解代謝

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2020-07-06
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是一種以代謝異常為特征的致死性疾病。糖酵解相關(guān)的lncRNA在NSCLC侵襲行為中的作用機(jī)制尚不清楚...

    非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是一種以代謝異常為特征的致死性疾病。糖酵解相關(guān)的lncRNA在NSCLC侵襲行為中的作用機(jī)制尚不清楚。因此小編為大家詳細(xì)介紹發(fā)表于“Theranostics”上的文章“Hypoxia-induced lncRNA-AC020978 promotes proliferation and glycolytic metabolism of non-small cell lung cancer by regulating PKM2/HIF-1α axis”,讓大家了解lncRNA-AC020978促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和糖酵解代謝的分子機(jī)制。

    在本研究中,我們采用實(shí)時(shí)定量PCR和熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)AC020978在NSCLC中的表達(dá)水平。通過(guò)體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn),研究了AC020978在細(xì)胞增殖和有氧糖酵解中的生物學(xué)作用。采用雙熒光素酶報(bào)告基因、染色質(zhì)免疫沉淀法檢、RNA下拉法等實(shí)驗(yàn)方法研究了AC020978的分子機(jī)制。
結(jié)果:
1.AC020978在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義
    
為了探討AC020978在腫瘤中的臨床意義,我們對(duì)NSCLC及其鄰近組織進(jìn)行了FISH檢測(cè)。如圖1A和1D所示,AC020978在腫瘤組織中過(guò)表達(dá),在鄰近的非腫瘤組織中很少表達(dá)。此外,AC020978的表達(dá)隨著TNM的進(jìn)展而增加(圖1B,1E)。Kaplan-Meier分析顯示AC020978的高表達(dá)與這些患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)(P<0.01,圖1C)。
    為進(jìn)一步評(píng)價(jià)AC020978的病理和臨床預(yù)測(cè)價(jià)值,對(duì)AC020978、TNM和AC020978與TNM聯(lián)合應(yīng)用組進(jìn)行ROC分析。AUC數(shù)據(jù)顯示,聯(lián)合模型高于單用TNM模型(圖1F)。隨后,我們發(fā)現(xiàn)AC020978表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(圖1G)。總之,這些結(jié)果提示AC020978可能是NSCLC的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。

2.AC020978是NSCLC細(xì)胞中的一種致癌lncRNA
    為了闡明AC020978在細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用,我們用兩種不同的siRNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞。Si-0978#1對(duì)AC020978的抑制作用最強(qiáng)。qRT-PCR證實(shí)AC020978的表達(dá)可增加1000倍以上(圖2A)。
    為探討AC020978在NSCLC進(jìn)展中的生物學(xué)作用,采用CCK-8、EdU染色、集落形成分析等方法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究。結(jié)果表明在A549和H1299細(xì)胞中,AC020978基因敲除后,細(xì)胞增殖顯著減弱。此外,重新表達(dá)AC020978可以挽救減弱的細(xì)胞增殖率(圖2B-C)。在功能增益分析中,AC020978的過(guò)表達(dá)加速了H1299細(xì)胞的增殖效應(yīng)(圖2E-2F)。采用Transwell法檢測(cè)AC020978在NSCLC細(xì)胞中的遷移能力。結(jié)果表明,AC020978異位表達(dá)的H1299細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),而AC020978的下調(diào)與陰性對(duì)照相比抑制了A549和H1299細(xì)胞的遷移活性,而AC020978在穩(wěn)定的AC020978敲除細(xì)胞中的重新表達(dá)可以挽救減弱的細(xì)胞遷移(圖2D和2G)。

3.AC020978是在代謝應(yīng)激下誘導(dǎo)的,是糖酵解代謝重編程的關(guān)鍵
    
為了闡明AC020978在代謝應(yīng)激下是否對(duì)細(xì)胞存活起作用,我們采用2.5mM到25mM的葡萄糖濃度梯度模擬葡萄糖剝奪條件。如圖3A-3D所示,AC020978是由葡萄糖剝奪或2-DG治療以劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)的方式誘導(dǎo)的,表明AC020978可能在細(xì)胞對(duì)代謝應(yīng)激的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
    其次,檢測(cè)AC020978是否直接影響葡萄糖代謝。如圖3E和3F所示,AC020978的沉默提高了最大呼吸強(qiáng)度, AC020978的敲除明顯降低了A549細(xì)胞的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)備。相比之下,AC020978的過(guò)表達(dá)在H1299細(xì)胞中表現(xiàn)出相反的代謝通量(圖3G和3H),表明AC020978促進(jìn)了糖酵解途徑。此外,AC020978下調(diào)的A549細(xì)胞18F-FDG攝取和乳酸生成顯著減少,而在H1299細(xì)胞中異位誘導(dǎo)的AC020978表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)作用(圖3I-J)。此外,我們還測(cè)量了幾種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的蛋白質(zhì)水平。Western blotting結(jié)果顯示,AC020978表達(dá)的改變對(duì)它們有積極影響(圖3K)。這些數(shù)據(jù)表明AC020978是一種葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的lncRNA,可以調(diào)節(jié)NSCLC的糖酵解代謝。
    由于HIF-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)缺氧和低葡萄糖供應(yīng)的重要基因,因此在葡萄糖饑餓條件下分析了HIF-1α的蛋白水平和反式激活(圖3L)。結(jié)果表明,HIF-1α和HIF-1α響應(yīng)的熒光素酶報(bào)告均受低葡萄糖誘導(dǎo)。有趣的是,與較長(zhǎng)的供應(yīng)相比,24小時(shí)的HIF-1α蛋白表達(dá)最高,而48小時(shí)的HIF-1α響應(yīng)性熒光素酶活性最高,這表明癌細(xì)胞可能不斷適應(yīng)其代謝應(yīng)激微環(huán)境。

4.AC020978促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)有氧糖酵解
    
為了探討AC020978在體內(nèi)的作用,我們建立了AC020978基因敲除的A549細(xì)胞系,并建立異種移植模型。如圖4A-B和4D所示,與對(duì)照組相比,AC020978基因敲除顯著降低了腫瘤體積和腫瘤重量。此外,來(lái)自對(duì)照組的異種移植體具有相對(duì)較強(qiáng)的18F-FDG積累,而AC020978下調(diào)組的18F-FDG攝取量要低得多(圖4C-4E)。異種移植組織的IHC染色表明AC020978介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)和糖酵解(圖4F-4G)。總之,這些結(jié)果表明AC020978在促進(jìn)NSCLC增殖和糖酵解方面發(fā)揮了重要作用。

5.AC020978是缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α直接反式激活因子
    
我們探討了導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌AC020978高表達(dá)的原因。利用啟動(dòng)子序列分析工具對(duì)編碼AC020978基因進(jìn)行了檢測(cè)。在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)假定的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)(圖5D)。缺氧或其化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2處理24小時(shí)后,A549和H1299細(xì)胞中AC020978的表達(dá)明顯升高,與HIF-1α表達(dá)上調(diào)一致(圖5A)。相反,HIF-1α基因敲除顯著抑制AC020978在常氧和缺氧條件下的表達(dá)(圖5B-5C)。另外,ChIP-qPCR分析表明HIF-1α直接與AC020978基因兩個(gè)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)片段結(jié)合(圖5G)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α對(duì)AC020978轉(zhuǎn)錄的激活作用,進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。與預(yù)期的一樣,在含有野生型啟動(dòng)子(WT)的細(xì)胞中,缺氧顯著提高了熒光素酶的密度。然而,HIF-1α的敲除顯著抑制了含有WT啟動(dòng)子的熒光素酶密度(圖5E-F,H-5I)。綜上所述,我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明AC020978是HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。

6.AC020978與PKM2物理結(jié)合并介導(dǎo)PKM2蛋白的穩(wěn)定性
    
我們進(jìn)行RNA下拉和質(zhì)譜分析篩選AC020978相互作用蛋白,如圖6A所示。 RIP分析結(jié)果表明,在PKM2免疫復(fù)合物中,AC020978共沉淀有一個(gè)穩(wěn)定而特異的富集(圖6B)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKM2蛋白特異性地與AC020978的序列結(jié)合(圖6C)。
    接下來(lái),我們嘗試探索這種AC020978-PKM2相互作用的分子功能。我們發(fā)現(xiàn)AC020978表達(dá)的改變調(diào)節(jié)了PKM2蛋白水平(圖6D)因此,我們推測(cè)AC020978可能調(diào)節(jié)PKM2蛋白的穩(wěn)定性。我們觀察到,通過(guò)在A549細(xì)胞中添加MG-132,明顯恢復(fù)了通過(guò)AC020978下調(diào)而降低的PKM2蛋白水平(圖6E)。環(huán)己酰亞胺(CHX)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AC020978下調(diào)細(xì)胞中PKM2的半衰期較短,而AC020978高表達(dá)細(xì)胞中PKM2的半衰期較長(zhǎng)(圖6F),提示AC020978對(duì)PKM2的調(diào)控可能是通過(guò)抑制蛋白酶體降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
    最后,我們通過(guò)體外泛素化試驗(yàn)檢測(cè)了AC020978是否參與了泛素介導(dǎo)的PKM2降解。下調(diào)AC020978可提高A549細(xì)胞PKM2蛋白泛素化水平。泛素介導(dǎo)的PKM2的降解作用在AC020978高表達(dá)H1299細(xì)胞中被顯著抑制(圖6G)。這些結(jié)果表明,AC020978通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解有助于維持PKM2蛋白的穩(wěn)定性。

7.AC020978促進(jìn)PKM2的核移位并調(diào)節(jié)PKM2增強(qiáng)的HIF-1α反式激活活性   
    免疫熒光染色顯示,AC020978可調(diào)節(jié)PKM2的表達(dá)。在A549陰性對(duì)照細(xì)胞中,PKM2主要存在于胞漿中。而在AC020978敲除細(xì)胞中,幾乎看不到任何可檢測(cè)到的核PKM2。當(dāng)比較AC020978高表達(dá)細(xì)胞中PKM2的細(xì)胞分布時(shí),可以看到核PKM2水平的增加(圖6H)。對(duì)A549和H1299細(xì)胞核質(zhì)和胞質(zhì)組分的Western blotting分析表明,PKM2主要在胞質(zhì)組分中表達(dá)。A549細(xì)胞沉默AC020978后,PKM2的細(xì)胞核和胞漿部分信號(hào)降低。然而,根據(jù)免疫熒光結(jié)果(圖6I),異位表達(dá)的AC020978表現(xiàn)出一定程度的核和胞漿PKM2信號(hào)的增加。
    我們猜測(cè)AC020978參與了PKM2/HIF-1α途徑的激活。首先,我們采用co-IP技術(shù)探討AC020978是否能調(diào)節(jié)PKM2與HIF-1α的相互作用。結(jié)果表明,敲除AC020978的功能受損,但AC020978的過(guò)表達(dá)明顯增強(qiáng)了PKM2和HIF-1α的相互作用(圖7A)。此外,為了可視化天然蛋白質(zhì)復(fù)合物,我們使用原位鄰近連接分析(圖7B)。在AC020978沉默條件下,發(fā)現(xiàn)含有PKM2和HIF-1α的PLA陽(yáng)性蛋白復(fù)合物較少。相反,在AC020978高表達(dá)組中發(fā)現(xiàn)PKM2/HIF-1α簇的整體高密度,這與co-IP的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果一致。
    接下來(lái),我們確定AC020978是否調(diào)節(jié)PKM2刺激的HIF-1α的反式作用。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明,在缺氧條件下,PKM2的異位表達(dá)均能提高HRE報(bào)告活性,而AC020978和PKM2的聯(lián)合表達(dá)則能協(xié)同增強(qiáng)啟動(dòng)子活性(圖7C)。缺氧條件下檢測(cè)HIF-1α靶向基因GLUT1、LDHA、ENO1和PDK1的表達(dá)。AC020978和PKM2的共轉(zhuǎn)染對(duì)所有這些基因都表現(xiàn)出較高的表達(dá)(圖7D)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明AC020978增強(qiáng)PKM2增強(qiáng)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。

結(jié) 論:
    
AC020978是一種上調(diào)的lncRNA,在NSCLC中具有臨床意義,有望成為NSCLC預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立生物標(biāo)志物。靶向AC020978/PKM2/HIF-1α軸可能為NSCLC的防治提供新的視角。