糖尿病性的視網膜病，了解一下？不急，circRNA在捉妖！
糖尿病性視網膜?。―R）是工齡較長者失明的主要原因，血管周細胞變性是DR的主要臨床表現，但對周細胞變性的機制了解甚少。circRNA在多種生物學過程和疾病進展中起重要作用，本文研究了circRNA在周細胞生物學和糖尿病引起的視網膜血管功能障礙中的作用。
主要結果如下：
1、在周細胞中鑒定發現cZNF532是一種高糖調節的circRNA
以正常血糖（NG）濃度，NG加滲流控制對照（OS），和高血糖（HG）濃度的三個血糖水平的人類視網膜周細胞為材料進行測序。在HG和NG組間共鑒定到1523個差異表達circRNAs（625個上調，898個下調），在HG和OS組間共鑒定到792個差異表達circRNAs（386個上調，406個下調）。任意挑選出5個上調和5個下調的差異表達circRNAs進行qRT-PCR驗證，結果發現，circ_0047814是最顯著上調的circRNA，其宿主基因為ZNF532，因而將其命名為cZNF532。Sanger測序證實，cZNF532在視網膜周細胞中構成性表達，不可被RNase R 消化，且主要在細胞質中表達（圖1A-C）。
進一步研究，體內體外糖尿病應激是否影響cZNF532在周細胞中的表達。如圖1D所示，在小鼠體內，與非糖尿病對照組相比，cZNF532在糖尿病血管中的表達明顯上調，且隨著糖尿病病程時間延長差距逐漸增大。與正常血糖組相比，cZNF532在HG組的人視網膜周細胞中高表達，類似的，在H2O2或炎癥刺激下，cZNF532在人視網膜周細胞中高表達；與此相反，cZNF532在人視網膜血管上皮細胞（HRVECs）中的表達則不受高血糖、H2O2或炎癥刺激的影響（圖1E-H）?？傊琧ZNF532表達響應周細胞中血糖含量的變化。
圖1 在周細胞中鑒定發現cZNF532是一種高糖調節的circRNA
2、在體外cZNF532調節周細胞功能
鑒定cZNF532是否在體內調控周細胞的功能，使用cZNF532 siRNA1干擾cZNF532的表達，結果發現，周細胞外膜細胞標記物的表達也隨之降低，包括血小板衍生生長因子受體(PDGFR) –β，α-SMA，肌腱線蛋白和NG2（圖2A）；并且周細胞向HRVECs的補充也下降了（圖2B）；但增加了周細胞中大分子的通透性（圖2C）。然后進一步確定異常的周細胞分化和補充是否與細胞活力或增殖的改變有關。結果顯示，沉默cZNF532后，周細胞活力和增殖均下降；而S期細胞的數量下降了3倍，G1期的細胞數量則增加了約30%；此外，還導致高血糖或氧化應激誘導的細胞凋亡水平加劇（圖2D-H）?？傊?，實驗證實， cZNF532可在體外調節周細胞的膜結構，細胞活力和增殖。
圖2 cZNF532在體外調節周細胞功能
3、cZNF532在體內調節視網膜周細胞功能和血管完整性
采用IB4和NG2免疫熒光染色法檢測視網膜血管中周細胞覆蓋率。如圖3所示，糖尿病模型構建1個月時，沉默cZNF532或糖尿病本身均對周細胞覆蓋率沒有影響，而糖尿病和cZNF532沉默結合作用時或下調周細胞覆蓋率；在2/4/6月時，沉默cZNF532或糖尿病本身均會導致周細胞覆蓋率下降，兩者結合作用時下調比率更大(圖3A-B)。此外，還發現，cZNF532沉默和糖尿病兩個實驗因素協同作用會加重糖尿病誘導的視網膜血管滲漏，這與cZNF532改變周細胞覆蓋率的結果相似(圖3C-D)。
圖3 cZNF532在體內調節視網膜周細胞功能和血管完整性
4、在活體條件下，細胞內cZNF532基因的下調會誘發視網膜血管功能障礙
IB4和NG2染色顯示，與非糖尿病Cre組(Cre)或糖尿病Cre組(DR)相比，1/2/4/6個月時，周細胞特異性敲低cZNF532 (DR+cZNF532 shRNA)降低了視網膜血管周細胞覆蓋率(圖4A-B)。此外，Evans blue檢測顯示，與Cre組或DR組相比，周細胞特異性敲低cZNF532 (DR+cZNF532 shRNA)進一步加重了視網膜血管滲漏(圖4C-D)。上述結果表明，特異性下調cZNF532的表達可誘導視網膜血管功能障礙。
圖4 在活體條件下，細胞內cZNF532基因的下調會誘發視網膜血管功能障礙
5、在體外cZNF532作為miRNA海綿調控周細胞功能
由于cZNF532主要在周細胞的細胞質中表達，因而推測cZNF532通過作為miRNA海綿在轉錄后水平調控周細胞的功能。使用熒光素酶實驗檢測cZNF532與預測的有結合位點的miRNA之間的關系，結果顯示miR-29a-3p、miR-498和miR-758轉染降低了LUC-cZNF532細胞的熒光素酶活性，而對LUC-cZNF532突變的熒光素酶活性沒有影響（圖5A-B）。隨后檢測cZNF532、miR-29a-3p、miR-498和miR-758在周細胞和小鼠視網膜中的相對表達豐度，與miR-498和miR-758相比，cZNF532和miR-29a-3p的表達豐度較高（圖5C-D）。因此，后續主要研究miR-29a-3p在周細胞中的表達，結果顯示，在周細胞胞質中，cZNF532和miR-29a-3p的存在共表達 ，且cZNF532與miR-29a-3p有三個潛在結合位點；熒光素酶等實驗進一步證實cZNF532充當了miR-29a-3p的海綿，并通過將miR-29a-3p從它的目標基因隔離而削弱了miR-29a-3p活性（圖5E-I）。不僅如此，作者通過實驗證明，過表達cZNF532不僅可以顛倒miR-29a-3p對周細胞活力和增殖的影響，還可以緩解周細胞因miR-29a-3p介導的促凋亡作用。
圖5 在體外cZNF532作為miRNA海綿調控周細胞功能
6、cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2網絡在體內調節視網膜周細胞功能和血管完整性
然后在體內研究了miR-29a-3p在視網膜血管功能障礙中的作用。miR-29a-3p agomir或cZNF532沉默導致NG2，LOXL2和CDK2表達增加。miR-29a-3p agomir可以模擬cZNF532沉默對視網膜血管功能障礙的影響，如圖6所示，在糖尿病性視網膜中，注射miR-29a-3p agomir會降低周細胞覆蓋率，加劇血管滲漏，并增加微動脈瘤，無細胞毛細血管和周細胞重影。
圖6 在體內cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2信號通路調節視網膜周細胞功能和血管完整性
7、cZNF532/miR-29a-3p/NG2、LOXL2和CDK2信號通路在視網膜血管功能障礙中的臨床意義
收集36例眼部玻璃體樣本，分成4類，非糖尿病對照樣本(Ctrl，n=8)，無增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)的糖尿病黃斑水腫(DME) (n=12)，有PDR的DME (n=12)，虹膜新生血管(NVI)，代表DR最嚴重(n=4)。qRT-PCR顯示，在患有DME，PDR或NVI的患者玻璃體中，cZNF532的表達上調，并且其表達與疾病的嚴重程度相關（圖7A）。相比之下，在四類患者中，玻璃體患者的miR-29a-3p表達沒有改變（圖7B）。 此外，與非糖尿病對照相比，DME，PDR或NVI患者玻璃體中NG2，LOXL2或CDK2的濃度上調。將周細胞與來自PDR患者的玻璃體一起溫育，結果發現，通過cZNF532過表達或miR-29a-3p抑制誘導cZNF532介導的信號轉導，可以保護周細胞免受糖尿病性玻璃體誘導的周細胞凋亡的影響（圖7C-D）。此外，共注射cZNF532過表達載體或miR-29a-3p antagomir可降低糖尿病玻璃體對視網膜血管通透性的影響，這類似于抗VEGF對視網膜血管通透性的影響（圖7E）。cZNF532過表達或miR-29a-3p抑制作用可降低糖尿病性玻璃體誘導的周細胞變性（圖7F）。
圖7 cZNF532/miR-29a-3p/NG2、LOXL2和CDK2信號通路在視網膜血管功能障礙中的臨床意義
總之，如圖8所示，這項研究中表明在糖尿病應激下的周細胞中，糖尿病鼠模型的視網膜血管中以及糖尿病患者的玻璃體液中，cZNF532的表達上調。 cZNF532通過充當miR-29a-3p海綿并誘導NG2，LOXL2和CDK2的表達增加來調節視網膜周細胞變性和血管功能障礙。cZNF532過表達或miR-29a-3p抑制可防止糖尿病引起的視網膜周細胞變性和血管功能障礙。
圖8 cZNF532在視網膜血管功能障礙中的作用及機制
此外，作者表明不能排除cZNF532在體內通過靶向內皮細胞調節視網膜血管功能的可能性。雖然cZNF532調節視網膜周細胞變性和血管功能障礙的結果令人鼓舞，但需承認，仍需要通過改進條件circRNA敲除技術，進一步的來明確cZNF532在DR中的確切作用。
參考文獻：
Jiang Qin., Liu Chang., Li Chaopeng., Xu Shanshan., Yao Mudi., Ge Huimin., Sun Yanan., Li Xiumiao., Zhang Shujie., Shan Kun., Liu Baihui., Yao Jin., Zhao Chen., Yan Biao.(2020). Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J. Clin. Invest., undefined(undefined), undefined. doi:10.1172/JCI123353