減少淀粉樣蛋白β（Aβ）積累可能是阿爾茨海默病（AD）一個潛在的治療方法。微環境賦予外泌體特殊的功能生物分子，原細胞所在的微環境可將其轉移到受體細胞以改善病理條件。然而，很少有關于外泌體治療AD的報道。在此，小編為大家介紹一篇發表于Small的文章：“The Regulatory Functionality of Exosomes Derived from hUMSCs in 3D Culture for Alzheimer’s Disease Therapy”。

    3D石墨烯支架和2D石墨烯薄膜均被用作人臍帶間充質干細胞（huMSCs）培養的基質，從中獲得上清液來分離外泌體。3D培養的外泌體（3D-Exo）中195種miRNAs和蛋白的水平與2D培養的明顯不同。因此，3D-Exo可以調控α-secretase的表達和抑制β-secretase，從而減少AD病理細胞和轉基因小鼠中Aβ的產生。3D-Exo增強AD小鼠的記憶和認知功能。這些發現為干細胞來源的支架材料和功能性外泌體提供了新的臨床應用。
結果：
（1）3D石墨烯支架合成及hUMSC培養
    三維石墨烯支架和二維石墨烯薄膜均采用化學氣相沉積法合成。掃描電鏡觀察結果顯示，3D支架呈整體、連續、多孔結構，孔隙率為99.5%±0.2%（圖1a）。三維支架的孔隙大小是100-300μm，石墨烯骨架的寬度是100-200μm。3D支架的厚度為1.68 mm（圖1b），而2D膜是由3-5層碳片組成。已知石墨烯薄膜具有非生理硬度，3D支架的剛度值為30±0.55 kPa。圖像顯示，3D支架在微納米尺度上具有許多波紋和褶皺（圖1c），與二維膜的光滑表面形成對比（圖1d）。
    使用免疫熒光染色和流式細胞術培養和鑒定hUMSCs。SEM顯微照片顯示，廣泛分布的hUMSCs與2D膜和3D支架形成了強烈的相互作用（圖1e，f）。在2D膜上，hUMSCs表現出典型的擴張形態和顯著的肌動蛋白絲（圖1g）。相反，我們觀察到細胞在3D支架上擴散，穿過相互連接的孔壁，并與鄰近的細胞建立物理接觸（圖1h）。

（2）外泌體及其含量特征
    在3D支架（3D- exo）和2D薄膜（2D-Exo）上培養的hUMSCs上清液中，通過超離心的標準方法分離出外泌體。根據透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析的結果，外泌體通常由直徑為50-150 nm的膜泡組成（圖2a）。western blotting檢測外泌體的標記物四聚體蛋白（CD9、CD63）和核內體途徑蛋白（Alix和TSG101）。結果顯示Alix和TSG101在外泌體中表達，而CD9和CD63同時在2D-Exo和3D-Exo中富集（圖2b）。外泌體中含有豐富的miRNA，在細胞間通訊中起著重要的作用。我們使用miRNA微陣列對外體miRNA進行了表征。與2D-Exo相比，195種miRNA在3D-Exo中的表達存在差異。其中68個miRNA上調，127個miRNA下調，如圖2c所示。對差異表達的miRNA進行GO分析和KEGG分析，我們推測這些3D-Exo中的miRNA對細胞行為、突觸、免疫和抗氧化作用至關重要。我們確定了36種miRNA可能與AD治療相關。我們通過real-time PCR進一步檢測了miR-126-3p、miR-137、miR- 144-3p、miR-188-5p、miR-425-3p和miR-451a的水平（圖2d），趨勢變化與芯片一致。
    此外，外泌體包含各種類型的蛋白質。本研究通過western blotting檢測NEP、IDE、HSP70和HSP90的水平。結果表明，與2D-Exo相比，3D-Exo中NEP、IDE和HSP70的含量顯著增加（圖2e）。與此同時，兩種外泌體中HSP90的表達水平無差異，且這些蛋白在hUMSCs中的表達水平無明顯變化。這些結果表明，來自于hUMSCs的外泌體的miRNA和蛋白質受到3D支架培養的影響。

（3）3 D-exo減少分泌和細胞內AβAD病理細胞模型
    為了調查外泌體對Aβ積累減少的影響，用3D-Exo或2D-Exo處理APPswe細胞。共聚焦成像顯示APPswe細胞上DiO點的熒光表明受體細胞具有較高的攝取效率（圖3a）。ELISA結果顯示3D-exo能更好地降低Aβ42在細胞內的積累（圖3 b，3c）。此外，免疫熒光染色顯示，細胞內Aβ42積累在3D-exo組顯著降低（圖3 d）。另外，在外泌體處理后，α-secretase ADAM10 mRNA和蛋白表達上調，β-secretase BACE1表達下調（圖3e，3f）。其中，3D-Exo組的效果更明顯。

（4）3D-Exo能改善APP/PS1轉基因小鼠的空間學習和記憶功能
    我們在9個月大的APP/ PS1轉基因小鼠右海馬區連續給予3D-Exo和2D-Exo 14 天。為了評估3D-Exo對AD小鼠空間學習和記憶功能的影響，外泌體給藥后進行Morris水迷宮實驗。結果表明，與野生型小鼠相比，生理鹽水（NS）處理小鼠在空間學習和記憶方面表現出明顯的缺陷。與NS組和2D組相比，3D-Exo處理的AD小鼠在第3天表現出顯著的空間學習改善。第4、5天外泌體注射組小鼠的逃逸潛伏期短于NS注射組，此外，3D-Exo組在第5天的空間學習能力優于2D-Exo組（圖4a）。在第6天進行空間探針測試，對小鼠的空間記憶進行評估，并在60 s內記錄小鼠的運動軌跡（圖4b）。令人印象深刻的是，與注射2D-Exo的小鼠相比，3D-Exo組表現出更多的平臺交叉、在目標象限花費的時間和距離（圖4c-e）。因此，3D-Exo在改善AD小鼠認知行為方面明顯優于2D-Exo。

（5）3D-exo緩解Aβ在APP / PS1轉基因小鼠的沉積
    為了研究外泌體在小鼠大腦中的分布，我們將Dio標記的外泌體移植到AD小鼠右海馬。熒光成像顯示，外泌體廣泛分布于腦實質，主要集中在右海馬，而在左海馬可見少量外泌體（圖5a）。Morris水迷宮測試后，評價外泌體對Aβ沉積的影響。免疫組織化學染色圖像顯示Aβ42在外泌體處理的AD小鼠的右海馬中的積累減少。Aβ42在3D外泌體處理的小鼠海馬中沉積的區域更?。▓D5b）。接著，為了評估外泌體是否通過調節海馬體內的分泌酶減少Aβ產生，ADAM10和BACE1的mRNA和蛋白表達水平被檢測。RT-PCR和免疫印跡結果表明3D-Exo導致ADAM10 mRNA表達上調，BACE1表達下調（圖5c，5d）。

（6）3D-Exo抑制炎癥和氧化應激
    我們分析了小膠質細胞的激活，這是神經炎癥的標志性特征之一。小膠質細胞標記物Iba-1在AD小鼠中顯著增加。注射3D-Exo可顯著降低右側海馬Iba-1的mRNA表達。3D-Exo注射組Iba -1陽性小膠質細胞密度低于2D-Exo組和NS組（圖6a）。此外，TNF-α和IL-1β在外泌體處理的AD小鼠海馬中下調。與2D-exo組相比，TNF-α和IL-1β在3D-exo組表達水平更低（圖6b，6c）。RT-PCR和免疫組化結果顯示，3D-Exo處理后AD小鼠HO-1 mRNA和蛋白表達明顯下降（6d）。這些數據表明，3D-exo可以更好的減輕炎癥、氧化應激和減少Aβ積累。

結論：
    來自3D支架培養的hUMSCs的外泌體可以減少Aβ的積累、改善APP/PS1轉基因小鼠的空間學習和記憶功能。這為從3D支架上培養的hUMSCs獲得的外泌體用于AD和其他疾病的治療提供了新的治療干預和潛在的臨床應用。