導(dǎo)語(yǔ)
    細(xì)胞外囊泡(EVs)已經(jīng)成為細(xì)胞間通訊的新型介質(zhì)，能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)移治療性microRNAs (miRNAs)，因此，EVs作為一種用于癌癥治療的miRNA傳遞系統(tǒng)具有巨大的潛力。此外，隨著含有mirna的EV被分泌到循環(huán)中，血漿EV中包含的mirna可能成為疾病的理想生物標(biāo)志物。本文將描述一種潛在的腫瘤抑制因子miRNA, miR-101，并探討通過(guò)EVs傳遞miR-101用于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤體內(nèi)治療的潛力，以及血漿EV-packaged miR-101 (EV-miR-101)水平預(yù)測(cè)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值。
技術(shù)路線                   
1.通過(guò)原位雜交(ISH)研究miR-101在骨肉瘤中的表達(dá)與骨肉瘤進(jìn)展的關(guān)系
2.利用體內(nèi)模型進(jìn)一步研究了miR-101的潛在抑制作用
3.利用預(yù)測(cè)軟件分析，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、western blotting和雙熒光素酶分析探討miR-101在骨肉瘤中的作用機(jī)制。
4.將脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(AD-MSCs)與慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得富含mir -101的EV。
5.采用Transwell實(shí)驗(yàn)和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型觀察富mir -101的EVs對(duì)骨肉瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移的影響。
6.應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤患者和健康對(duì)照組血漿EV-miR-101水平。
研究結(jié)果:
1.miR-101的下調(diào)與骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)移進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)
    探討miR-101在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的作用，進(jìn)行了原位雜交(in situ hybridization, ISH)來(lái)評(píng)估m(xù)iR-101的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，miR-101在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤標(biāo)本中的表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤標(biāo)本。根據(jù)骨肉瘤標(biāo)本中miR-101表達(dá)的ISH分?jǐn)?shù)，114例骨肉瘤患者被分為高miR-101表達(dá)組和低miR-101表達(dá)組。如表所示，與高miR-101表達(dá)組相比，低miR-101表達(dá)組轉(zhuǎn)移率更高，臨床分期更晚。此外，低miR-101表達(dá)組的總生存時(shí)間也比高miR-101表達(dá)組短。總之，miR-101表達(dá)下降預(yù)示預(yù)后不良，可能是與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的刺激有關(guān)。

 
2.在體內(nèi)模型中，miR-101對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用
    探討miR-101是否能抑制體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移，通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-101的骨肉瘤細(xì)胞系，并通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。建立體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移模型,sosp - 9607細(xì)胞表達(dá)mir – 101。病毒顆粒通過(guò)尾靜脈注入裸鼠實(shí)驗(yàn)。7周后處死小鼠，結(jié)果顯示，與注射了nc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系的小鼠相比，注射了SOSP-9607-101或Saos-2-101細(xì)胞的小鼠與注射了nc轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系的小鼠相比，轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)明顯減少，肺重量明顯降低。此外，為了排除miR-101對(duì)細(xì)胞增殖的影響，這可能影響體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的形成，我們使用CCK-8法評(píng)估慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的SOSP-9607-101和Saos-2-101細(xì)胞的增殖，并與NC細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果miR-101的表達(dá)對(duì)這些骨肉瘤細(xì)胞的增殖幾乎沒(méi)有影響。

 
3.BCl6是miR-101在骨肉瘤細(xì)胞中的直接靶標(biāo)          
    鑒于mir - 101之間的序列同源性和3翻譯區(qū)(3 UTR) BCL6, 相對(duì)于數(shù)控同行， mir - 101表達(dá)升高的影響B(tài)CL6 mRNA和蛋白表達(dá)。此外，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，miR-101表達(dá)的升高顯著抑制了143B細(xì)胞和Saos-2細(xì)胞中野生型BCL6 3 UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，但未抑制突變型報(bào)告基因的活性。qRT-PCR分析15對(duì)匹配的骨肉瘤組織和相鄰正常組織中BCL6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中BCL6 mRNA水平較相鄰正常組織升高。在15例骨肉瘤標(biāo)本中，研究了miR-101和BCL6表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-101表達(dá)與BCL6 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。與miR-101的作用相比，BCL6顯著增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，BCL6的異位表達(dá)拯救了miR-101對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移的抑制。總之，這些數(shù)據(jù)表明，miR-101通過(guò)直接靶向BCL6來(lái)抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。

  
4.miR-101可以被成功包裝成脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(AD-MSC)來(lái)源的EV
    通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)包括CD31、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105在內(nèi)的陽(yáng)性和陰性間充質(zhì)干細(xì)胞(圖S2A)的表達(dá)，確認(rèn)分離的AD-MSCs的純度。多重感染(MOI)的慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后，在AD-MSCs中觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。重復(fù)流式細(xì)胞術(shù)分析間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，并觀察到工程化的AD-MSCs與天然的AD-MSCs之間無(wú)明顯差異。研究AD-MSCs的多向分化潛能，誘導(dǎo)其分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分別用油紅O、阿利新藍(lán)、茜素紅S染色鑒別分化的細(xì)胞。AD-MSCs與原生的AD-MSCs具有相同的多向分化潛能。miR-101在表達(dá)miR-101 (ad - ms -101)的AD-MSCs中的表達(dá)較經(jīng)qRT-PCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的NC病毒顆粒(ad - ms -NC)的AD-MSCs中的表達(dá)增加。差速離心從條件培養(yǎng)基中獲得EV，透射電鏡觀察ad - msc衍生的EV和納米顆粒跟蹤分析。western blotting檢測(cè)EVs的載脂蛋白B (APOB)蛋白標(biāo)記物。ad - msc -101衍生EVs (AD-MSC-101-EVs)中miR-101的含量顯著高于AD-MSC-NC衍生EVs (AD-MSC-NC-EVs)。

 
5.體外培養(yǎng)的AD-MSCs中，mir -101富集的EV可抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移
    143-B和Saos-2細(xì)胞有效地吸收了AD-MSC-101-EV，如143B和Saos-2細(xì)胞中miR-101水平的增加所證明的。隨后，這種攝取導(dǎo)致BCL6 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低。與用AD-MSC-NC-EVs或等體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）處理的細(xì)胞相比，用AD-MSC-101-EVs處理的骨肉瘤細(xì)胞顯示出顯著降低的侵襲和遷移能力。143B和Saos-2細(xì)胞遷移的傷口愈合測(cè)定結(jié)果與Transwell測(cè)定的結(jié)果一致。 

6.AD-MSCs中富含mir -101的EV可抑制體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移
    驗(yàn)證AD-MSCs中富含mir -101的EV是否具有治療體內(nèi)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的臨床潛力，將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶(143B-luci)的143B細(xì)胞注射到裸鼠脛骨近端形成腫瘤。2周后，AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS分別注射到小鼠尾靜脈，每周2次，共1個(gè)月。與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS均出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的6只小鼠中只有2只在腫瘤細(xì)胞注射后7周內(nèi)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。在小鼠犧牲后，與接受AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠相比，接受AD-MSC-101-EVs的小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和肺重量明顯減少。評(píng)價(jià)EV治療的體內(nèi)安全性，將15只裸鼠隨機(jī)分為3組(每組5只)，分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或等量PBS。在最后注射治療1周后，所有小鼠均被處死。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EV治療對(duì)肝腎功能無(wú)不良影響。對(duì)主要臟器進(jìn)行H&E染色，發(fā)現(xiàn)分別給予AD-MSC-101-EVs、AD-MSC-NC-EVs或PBS處理的小鼠無(wú)明顯毒性。

 
7. 血漿EV-miR-101顯示出作為骨肉瘤診斷性生物標(biāo)志物的潛力
    對(duì)差異表達(dá)的測(cè)序的結(jié)果，血漿樣本中一個(gè)骨肉瘤病人顯示了mir – 101在血漿EV的存在,以及減少的mir - 101等離子EVs的骨肉瘤病人與健康控制。進(jìn)一步驗(yàn)證診斷潛在的EV - mir - 101,共檢測(cè)61例骨肉瘤患者(41例，診斷時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)移)和健康對(duì)照組(20例)的血漿標(biāo)本。與健康對(duì)照組相比，骨肉瘤患者的EV-miR-101表達(dá)較低。此外，與無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者(n=27)相比，有轉(zhuǎn)移的患者(n=14)的miR-101水平更低然后進(jìn)行受試者工作特性(Receiver operating characteristic, ROC)曲線分析，以評(píng)估血漿EV-miR-101作為診斷骨肉瘤的非侵入性生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。結(jié)果表明，EV-miR-101水平可有效區(qū)分骨肉瘤患者與健康對(duì)照組(ROC曲線下面積)。另外，血漿EV-miR-101水平可以區(qū)分有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者和無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者。此外，血漿EV-packaged let-7i-5p (EV-let-7i-5p)的水平也被檢測(cè)，并顯示健康對(duì)照組和骨肉瘤患者之間沒(méi)有顯著差異。而且，無(wú)轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者與有轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的血漿EV-let-7i-5p水平無(wú)顯著差異。這些結(jié)果提示EV-let-7i-5p可作為未來(lái)骨肉瘤標(biāo)志物研究的內(nèi)源性對(duì)照。

總結(jié) :
    證明了miR-101是骨肉瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移的明確抑制因子，這些作用至少部分是通過(guò)調(diào)控BCL6介導(dǎo)的。來(lái)自AD-MSCs的EV顯示出作為miR-101體內(nèi)傳遞載體的巨大潛力。血漿EV-miR-101水平也具有作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的新的生物標(biāo)志物的激動(dòng)人心的潛力，盡管這項(xiàng)研究由于這些樣本的稀少而受到樣本量的限制。需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定血漿EV-miR-101水平在其他更大的患者群體中的臨床價(jià)值。但其結(jié)果為EV-miR-101在骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者新的診斷和治療策略中的潛在應(yīng)用提供了見(jiàn)解。