結腸癌（CRC）是一種侵襲性的原發性腸惡性腫瘤，在全球所有類型的癌癥中，其發病率均排在第三位，而其死亡率則位居第二。 因此，尋找新的CRC治療策略具有重要意義。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在癌細胞的表觀遺傳調控中起著不可忽略的作用。小編為大家帶來最新發表于Molecular Cancer上的文章：“LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer”。這項研究旨在確定一種特定的lncRNA，該基因可促進結直腸癌（CRC）的進展，并可能成為潛在的治療靶標。我們在人類CRC樣本中篩選了高表達的lncRNA，并將其與匹配的鄰近正常組織進行比較。RNA下拉和RNA免疫沉淀（RIP）分析證實了與LINRIS相互作用的蛋白質。在體外和體內測試了被LINRIS抑制的CRC細胞的增殖和代謝改變。

結果：
1.LINRIS在CRC中高表達，預后差
   為了探索可能影響CRC進展的lincRNAs，我們將CRC期患者的腫瘤組織與配對的鄰近正常組織進行RNA-seq轉錄組比較。基于RNA-seq分析，我篩選出7個高表達lncRNA，包括LINC00920（更名為LINRIS）（圖1a）。我們發現LINRIS的高表達與CRC患者的不良總生存相關（圖1b，c）。根據TCGA數據庫，與正常細胞中的表達相比，大多數類型的腫瘤和CRC細胞系中LINRIS的表達上調（圖1d和圖1e），這些結果表明LINRIS通常起致癌基因的作用。食管鱗狀細胞癌（ESCC），胃癌（GC）和胰腺導管腺癌（PDAC）的患者樣本中也顯示了LINRIS在消化道癌癥中的致癌狀態（圖1f）。接下來，我們用shRNA敲除CRC細胞中的LINRIS。 使用BrdU和3D培養法比較了用LINRIS特異性shRNA（sh-1和sh-2）轉染的CRC細胞與陰性對照（sh-NC），結果確定了LINRIS的促癌作用（圖1g-i）。 通過RNA FISH分析，我們發現LINRIS主要位于細胞質中（圖1j-l）。

2.LINRIS與IGF2BP2相互作用并維持其表達
   為了確定LINRIS誘導CRC細胞進程的分子機制，我們進行了RNA下拉測定和質譜分析，以探索可能與LINRIS相關的蛋白質。我們確定IGF2BP2作為我們的第一個靶標。如圖2a-d所示，LINRIS可以直接結合到IGF2BP2。為了定位靶向IGF2BP2的LINRIS的結合位點，我們首先構建了兩個截短的LINRIS載體并進行了RNA下拉測定，因為該lncRNA的長度僅為913 bp。但是，LINRIS的N端（1–570 nt）和C端（571–913 nt）片段都不能與IGF2BP2緊密結合（圖2e）。因此，根據其二級結構，我們構建了另一個帶有LINRIS 450-640 nt片段的載體。 RNA下拉分析表明該中間區域（450-640 nt）負責LINRIS和IGF2BP2之間的結合。
   通過測量LINRIS和IGF2BP2在人CRC細胞系中的表達，我們發現它們之間呈正相關（圖2f，g）。 HCT116和DLD-1細胞中的LINRIS敲低均顯著下調了IGF2BP2的表達（圖2h）。 此外，敲除LINRIS會顯著增加IGF2BP2的泛素化，但會抑制IGF2BP2調節的mRNA（圖2i）。 因此，我們認為IGF2BP2可能是LINRIS分子機制的關鍵，并且該lncRNA可能阻止了IGF2BP2的降解。

3.LINRIS保護IGF2BP2不被自噬降解
   IGF2BP2由2個RNA識別基序（RRM）和4 K同源性（KH）域組成，我們建立了3個帶有FLAG標簽的載體，其中包含IGF2BP2的片段在非活性區彼此重疊（圖3a）。 RIP分析表明LINRIS主要結合到RRM區域（圖3b）。 然后，我們從CPLM數據庫中獲得了實驗確定的IGF2BP2泛素化位點。 如圖3c所示，與野生型（WT）相比，代替K77R的K139R泛素突變顯著損害了IGF2BP2的泛素化。 此外，該突變還消除了RNA下拉測定法中LINRIS和IGF2BP2之間的結合（圖3d），表明LINRIS通過掩蓋K139抑制了IGF2BP2的泛素化。
   為了闡明IGF2BP的降解模式，用蛋白合成抑制劑CHX處理LINRIS表達下調的CRC細胞，其IGF2BP2半衰期比未處理的對照細胞要短（圖3e）。然而，在sh-LINRIS轉染的細胞中，當用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞時，內源性IGF2BP2表達不會增加（圖3f），這表明IGF2BP2的降解可能與比泛素-蛋白酶體途徑更復雜的機制有關。
   除了泛素-蛋白酶體系統（UBS），細胞蛋白在泛素化后可從自噬-溶酶體途徑（ALP）降解（圖3g）。如圖3h所示，內吞IGF2BP2蛋白的減少被自噬抑制劑bafilomycin A1（Baf A1），NH4Cl和3-甲基腺嘌呤（3-MA）成功逆轉。相反，自噬激活劑Earle的平衡鹽溶液（EBSS）和雷帕霉素（Rap）降低了IGF2BP2的水平（圖3i）。 EBSS處理的細胞還表現出IGF2BP2和LC3B的共定位增加（圖3j）。綜上所述，提示LINRIS介導的IGF2BP2降解是通過泛素化自噬途徑實現的。

4.LINRIS與IGF2BP2相互作用影響MYC介導的糖酵解
   由于MYC的mRNA被IGF2BP2識別為其眾所周知的下游靶點，我們研究了LINRIS與IGF2BP2相互作用時糖酵解的變化。如圖4a、b所示，LINRIS被敲除后，其介導糖酵解的下游基因GLUT-1、PKM2、LDHA也表現出與MYC一致的水平下降。此外，MYC、GLUT-1、PKM2和LDHA的mRNA水平與CRC組織中的LINRIS水平呈正相關（圖4c）。如圖4d和e所示，沉默LINRIS可導致HCT116和DLD-1細胞糖酵解的減弱。圖4f顯示LINRIS基因敲除降低了一些典型的糖酵解產物。綜上所述，LINRIS對于維持癌細胞的糖酵解是必要的，糖酵解可能影響CRC的增殖。此外，我們用過表達IGF2BP2的質粒轉染了CRC細胞。 如圖4g-i所示，在HCT116和DLD-1細胞中，在某種程度上挽救了由LINRIS敲除誘導的增殖和糖酵解受損。

5.LINRIS的抑制抑制了體內CRC的生長
   為了研究低LINRIS表達是否會抑制體內CRC腫瘤的生長，我們向BALB/c裸鼠的盲腸注射了具有或不具有LINRIS敲低的HCT116細胞（sh-NC，sh-1和sh-2）。 與具有sh-1或sh-2的細胞相比，HCT116/sh-NC細胞在4周內形成了更大，更重的原位腫瘤（圖5a和b）。此外，我們用異種移植（PDX）模型測試了抗LINRIS治療的體內作用。如圖5c，d所示，通過RNAi抑制LINRIS可顯著抑制腫瘤的生長。切除的腫瘤切片的IHC染色顯示，隨著LINRIS的耗竭，與IGF2BP2和MYC一致的Ki-67表達降低（圖5e和f）。總體而言，阻塞LINRIS-IGF2BP2-MYC軸是有希望的CRC治療方法。

6.GATA3抑制LINRIS的轉錄活性
   為了研究調控LINRIS轉錄的因素，我們使用JASPAR數據庫預測了潛在的轉錄因子，并發現GATA3具有與LINRIS啟動子結合的最大可能性（圖6a）。使用Oncomine數據庫分析了來自多個實驗的CRC微陣列數據，該數據表明GATA3在CRC組織中的表達水平低于正常組織（圖6b）。此外，根據TCGA數據庫，更高的GATA3表達與CRC患者的更好預后相關（圖6c）。抑制GATA3成功地解放了LINRIS的轉錄（圖6d）。 ChIP-PCR分析顯示LINRIS啟動子區域被GATA3占據（圖6e），熒光素酶啟動子分析顯示GATA3過表達抑制LINRIS活性，反之亦然（圖6f，g）。此外，LINRIS啟動子中GATA3結合位點的突變消除了這種轉錄調控（圖6h）。通過分析中山大學癌癥中心的人類CRC樣本中LINRIS和GATA3的mRNA表達，我們還觀察到它們之間呈負相關（圖6i）。我們還通過RNA ISH分析測量了LINRIS的表達，并通過IHC分析測量了GATA3的表達（圖6j）。如圖6k所示，增加的LINRIS表達更可能伴隨著GATA3表達的降低，反之亦然。總之，GATA3抑制了LINRIS的轉錄。

7.LINRIS-IGF2BP2-MYC軸與CRC的發生發展密切相關
   為了進一步說明LINRIS-IGF2BP2-MYC軸在CRC發育中的臨床和病理學意義，我們分析LINRIS、Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的表達（圖7a）。如圖7b所示，高LINRIS組與Ki-67，IGF2BP2，MYC，GLUT-1，PKM2和LDHA的高表達相一致，而低LINRIS組表現出相反的結果。此外，與正常組織相比，這些患者的腫瘤組織中的IGF2BP2表達明顯更高（圖7c，d）。 IGF2BP2的較高表達也與CRC患者的預后不良有關（圖7e）。高LINRIS / IGF2BP2組的預后較其他兩組差（圖7f）。綜上所述，LINRIS-IGF2BP2-MYC軸深刻影響了CRC的發展和預后，并成為潛在的治療靶點。

結論：
   我們在CRC中發現了一種名為LINRIS的高表達lncRNA。LINRIS通過泛素化-自噬途徑阻斷IGF2BP2的降解。因此，MYC介導的糖酵解被下調，抑制了體內外CRC細胞的增殖。LINRIS-IGF2BP2-MYC軸促進CRC的進展。LINRIS是一種獨立的CRC預后生物標志物。