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細胞核內含物加載到外泌體的機制

欄目:最新研究動態 發布時間:2020-03-13
外泌體物質種類繁多,包括蛋白質、小RNA和基因組DNA(GDNA)。gDNA的存在表明不同的細胞內隔室有助于外泌體的裝載......

   外泌體物質種類繁多,包括蛋白質、小RNA和基因組DNA(GDNA)。gDNA的存在表明不同的細胞內隔室有助于外泌體的裝載,導致不同的外泌體亞群。然而,對gDNA和其他核內容進入外泌體(Nexo)的了解仍然很少。
   近期,一篇名為“Mechanisms of nuclear content loading to exosomes”的文章在《Science Advances》上發表。

   文章所述研究確定了作為基因組不穩定性標記的癌細胞微核(MN)與Nexo形成之間的關系。成像流式細胞術分析顯示,10%的來自癌細胞的外泌體和<1%的來自卵巢癌患者血液和腹水的外泌體含有核內容物。在體外和體內用基因毒性藥物治療導致MN和Nexos增加。觀察到多泡體前體和外泌體標記物,如Tetraspanins,直接與MN相互作用。總的來說,這項工作提供了與Nexos相關的新見解,這對癌癥生物標記物的開發具有影響。
技術路線:

結果:
1.卵巢癌外泌體含有細胞核內含物

   篩選了癌癥基因組圖譜(TCGA),以確定哪些腫瘤類型具有最高數量的染色體重復,是最不穩定的(圖1A)。在所研究的25種腫瘤類型中,觀察到高級別漿液性卵巢癌(HGSC)在中位倍體中排名第四,基因組高度不穩定,這與不良的臨床結果相關。使用HGSC臨床前模型,用低溫電子顯微鏡(Cryo-EM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和免疫印跡分析(圖1,B到D)檢測分離的外泌體的純度。為了確定外泌體是否攜帶核蛋白,對外泌體組分進行了質譜(MS)分析。在從OVCAR-5(OVCAR-5exo)細胞分離的外泌體中,檢測到一個201個核相關蛋白和17個染色體相關蛋白的HGSC細胞系,其中12.5%的被檢測蛋白是核來源的(圖1,E和F)。在這些發現的基礎上,使用全基因組測序(WGS)來比較來自OVCAR-5細胞和外泌體的DNA之間的CNVs(圖1G)。細胞和外泌體DNA之間的CNVs非常相似(圖1H)。雖然一些研究表明gDNA存在于外泌體中,但包含DNA的外泌體的亞群和包含DNA的外泌體的數量尚不清楚為了解決這個問題,使用Amnis Image Stream X,MkII流式細胞儀檢測如前所述的單個外泌體。采用這種方法分析Nexo,首先用CellMask質膜染色法對外泌體進行染色,然后加載到流動分析儀上。不同大小的珠子被用作設置外泌體種群的門的參考(圖1I)。為了鑒定gDNA的存在并量化DNA陽性外泌體的百分比,用DRAQ5對外泌體進行染色,DRAQ5是一種優先結合雙鏈DNA(dsDNA),浸透細胞以允許量化DNA陽性外泌體的百分比(圖1I)。此外,單粒子成像流式細胞術方法允許對DNA陽性外泌體的亞群進行定量,這些外泌體也對其他外體蛋白標記呈陽性,如tetraspanins(圖1I)。除了gDNA外,還檢測了外泌體中Lamin A/C的存在,Lamin A/C是一種核膜蛋白,存在于我們的OVCAR5-exo MS數據中(圖1,E和F)。觀察到Lamin A/C也可通過流式細胞術檢測到(圖1J)。與gDNA相反,Lamin A/C在OVACR5-exo中沒有那么豐富,但確實觀察到超過50%的DNA陽性外泌體也對Lamin A/C呈陽性(圖1J)。

圖一 卵巢癌外泌體核源性內含物的鑒定(D)TSG101、Alix和CD63用作外泌體標記,GRP94用作細胞污染的標記。Tcl,細胞總裂解物。(E)核成分以紅色突出顯示:1,內質網;2,內體;3,高爾基體;4,細胞表面;5,線粒體;6,蛋白酶體;7,液泡;8,剪接小體復合體。(F)x軸表示蜂窩室的類別。在染色體和細胞核中鑒定的核蛋白以紅色突出顯示。(G)外泌體DNA(內紅圈),細胞DNA(外藍圈。最外面的圓圈用坐標表示人類染色體(兆基)。藍色和紅色內圓內的綠色和紅色直方圖表示由cnvkit識別的拷貝數改變。軌道上的條形越大,拷貝數改變(對數刻度)越大。綠色條表示放大事件,紅色條表示刪除(I)左上:粒子顯示為黑點,外泌體位于綠色區域。右圖:每個點表示用CellMask Green(Ch02)染色的單個外泌體,紅色的框表示用DRAQ5(Ch11)染色的DNA陽性顆粒。左下角:單獨染色的外泌體的快照。(A)和(B)是存在于右圖所示區域的外泌體。(A)代表DNA陽性的外泌體,(B)代表陰性的外泌體。(J)左圖:每個綠點表示單個外泌體,藍色框表示Lamin A/C陽性群體。右圖:所有的點都來自DNA陽性的外泌體,綠色框表示Lamin A/C陽性的群體。

2.MN的誘導增加了攜帶DNA的外泌體的數量
   類似于gDNA在癌源外泌體中的存在,MN也由于其固有的基因組不穩定性而在癌細胞中更為普遍。基于這一想法,調查MN的存在與nExo之間是否存在任何關系。首先確定了原代健康輸卵管上皮細胞(FTE)中含有MN的細胞的基線數量,并與卵巢癌細胞系進行了比較。在原代FTE細胞中,被認為是許多HGSC的起源細胞,含有MN的細胞的盛行率為1%(圖2,A和B)。相反,大約4%的卵巢癌細胞含有MN(圖2,A和B)。比較健康細胞和癌細胞分泌的Nexo的數量,發現癌細胞分泌的Nexo群體明顯更高(FTEexo,0.12±0.04%;OVCAR-5exo,8.26±1.62%;和OVCAR-8exo,8.25±2.61%)(圖2,C和D)。這些數據表明,具有高度基因組不穩定性從而增加MN的細胞,如癌細胞,分泌更多數量的Nexos。為了進一步驗證假設,用基因毒性藥物topotecan(10 NM)或olaparib(20μM)處理卵巢癌細胞,以誘導MN的形成。無論使用哪一種藥物治療后,MN的數量顯著增加(圖2,E和F)。類似地,含有gDNA的外泌體(圖2,G和H)的數量在用這些藥物治療后也增加了。這些結果表明,誘導基因組不穩定性增加了MN產量,從而增加了Nexo豐度。

圖二 促進MN的形成增加了攜帶DNA的外泌體。(A)插圖顯示右側面板中微核OVCAR-5細胞的放大圖像。(C)兩個圖中的框都表示DNA陽性群體。(D)FTEexo,OVCAR-5exo和OVCAR-8exo中DNA陽性外泌體群體。(E)用Lamin A/C抗體對細胞核進行IF染色。(H)用DMSO,olaparib或topotecan處理親代細胞48小時。FTEexo、OVCAR-5exo和OVCAR-8exo分別表示來自FTE、OVCAR-5和OVCAR-8細胞的外泌體。
   為了在體內驗證這些發現,使用代表播散性腹膜疾病的OVCAR-5卵巢癌模型。如示意圖(圖3A)所示,每只荷瘤小鼠均接受最大耐受量的拓撲替康(7.5 mg/kg)治療,48小時后euthanasia。每只小鼠的腫瘤生長通過體內成像得到確認(圖3B)。為了確定拓撲替康是否可以誘導MN的形成,正如、體外觀察的那樣,收集腫瘤結節,切片,用H&E染色,通過強光和免疫熒光(IF)顯微鏡進行檢查(圖3,C和D)。H&E染色證實拓撲替康處理后MN的存在(圖3C)。為計算MN的數量,多次拍攝腫瘤切片的IF圖像,并且通過Vectra-Inform圖像分析系統(PerkinElmer)系統地計數MN(圖3D)。拓撲替康治療組與賦形劑對照組相比,有增加MN陽性細胞百分比的趨勢,盡管這個百分比在統計學上沒有顯著性(圖3E)。為了測量每次治療后Nexos產生量的差異,從各組荷瘤小鼠的血清和腹水中分離外泌體,通過冷凍-EM、NTA和CD63的Western blotting(圖3,F至H)確認它們的純度,并通過成像流式細胞術進行定量。荷瘤小鼠的血清中通常比非帶瘤小鼠有更多的Nexos(P=0.008)(圖3I)。將拓撲替康治療的小鼠與賦形劑對照組相比,我們觀察到腹水中Nexos的顯著增加(P=0.028),但血清Nexos沒有差異(圖3,J和K)。這些結果表明,腫瘤產生更多的Nexo,遺傳毒性藥物促進體內MN的形成,增加Nexo的釋放量。

圖三 基因毒性藥物在卵巢癌中對Nexos的體內促進作用。(C)黑色箭頭表示MN。(D)左上圖:DAPI和Palloidin染色的腫瘤組織的代表性圖像。右上圖:使用VECTRA成像軟件進行細胞分割的代表性圖像。下圖:檢測到的MN的代表性圖像,由白色箭頭指示。

3.MN和nExo在活細胞中共享內含物并相互作用
   接下來,比較MN和Nexos之間的相對核蛋白豐度。通過蔗糖梯度超速離心法分離OVCAR-5細胞中的MN,富集MN的組分洗滌并提交MS(圖4A)。用4‘,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和IF(圖4A)確認MN富集。MN組分的MS分析顯示OVCAR-5 MN和nExo蛋白含量之間有很大的相似性,兩個細胞隔室之間有127個蛋白質重疊(圖4,B和C)。這些共享的核蛋白包括Lamin A/C和組蛋白H2B以及一些外泌體標記,如熱休克蛋白(圖4C)。接下來,確定MN和外泌體相關蛋白是否在細胞內相互作用。外泌體標記如CD63,CD9和CD81的共聚焦成像顯示這些蛋白質在卵巢癌細胞的核膜或MN內共定位(圖4,D和E,以及圖S4A)。為了進一步探討這種相互作用是否發生在活細胞中,對過表達熒光標記的細胞的核蛋白和tetraspanins進行了延時成像。CD9和CD63都與OVCAR-5細胞中和MN積極相互作用(圖4,F和G)。這些發現表明,MN和Nexos都有很高的核含量,并且這些結構在活細胞內積極地相互作用。

圖四 MN和nExo含有相似的蛋白質內含物。(A)所有標本均取自OVCAR-5細胞,DAPI染色。中間圖像中的白色框是放大的視圖。(B)樣品取自OVCAR-5細胞。x軸表示單元組件的類別。來自細胞核和染色體隔間的蛋白質以黃色突出顯示。(C)樣品取自OVCAR-5細胞。重疊的127個蛋白中包括Lamin A/C、組蛋白H2A/B、Importin和熱休克蛋白(HSP)70/90。(D和E)mCherry-lamina/C-表達OVCAR-5細胞的連續共聚焦圖像。DAPI染色細胞核。CD63和CD9用抗體IF染色。(F)細胞膜用CellMask深紅染色。通過慢病毒感染細胞穩定表達綠色熒光蛋白(GFP)-CD63。(G)用mEmerald-CD9質粒瞬時轉染細胞。

4.破碎MN物質被裝載到外泌體中
   已知MN的包膜是不穩定的,當其崩潰時,包括gDNA在內的MN內含物暴露在細胞質中。因此,探究這種塌陷是否可以誘導MN內容加載到外泌體中。與先前的發現一致,卵巢癌細胞的共聚焦成像顯示一些MN沒有被它們的核膜包圍,表明MN塌陷(圖5,A和B)。觀察到可以作為MVBs標記物的Tetraspanin蛋白經常以部分或全部核膜塌陷包圍MN(圖5,A和B)。這些結果通過透射電子顯微鏡(TEM)得到了驗證(圖5,C至E)。這表明,與共聚焦觀察相似,卵巢癌細胞含有塌陷的MN(圖5C)。為了解決核內含物加載到外泌體背后的機制,假設塌陷的MN直接與外泌體生物合成的分子機制相互作用。外泌體最初由早期核內體的腔內囊泡形成,然后儲存在MVBs中。然后,通過MVBs與質膜的融合,這些囊泡作為外泌體釋放到細胞外空間。TEM顯示MVBs位于MN和早期核內體附近,因此可以直接與塌陷的MN相互作用(圖5,D和E)。此外,共聚焦分析顯示完整和塌陷的MN均對早期內體標志物EEA1呈陽性(圖5F)。這些結果表明gDNA可以以外泌體依賴或非外泌體依賴性的方式分泌,其中塌陷的MN可以與早期的核內體或自噬內涵體相互作用。為了進一步探索驅動MN內含物裝載到外泌體中的分子機制,重點研究了tetraspanins,如CD63,因為它們參與外泌體/MVB物質裝載。為了確定Tetraspanins對將MN內含物裝載到核內體并最終進入nExos是否是必需的,用短發夾狀RNA(ShRNA)敲除了卵巢癌細胞系中的CD63。在確認CD63蛋白敲除后(圖5G),通過流式細胞術檢測nExos數量的變化。CD63敲低的細胞比對照細胞分泌更少的nExos(圖5H),這表明CD63在向nExos中裝載核內含物方面起著重要作用。為了進一步探討CD63在nExo加載中的作用,進行了免疫沉淀(IP)實驗。來自OVCAR-5細胞裂解液的CD63pulldown揭示了與DNA和組蛋白H2B的聯系(圖5,I和J)。因此,CD63可以產生gDNA和核蛋白的復合物,并且可能對DNA在外泌體中的裝載起重要作用。

圖五 破碎MN貨物被裝載進nExos。(B)細胞核用DAPI染色,Lamin A/C和CD9用抗體IF染色。(C至E)黑色箭頭表示MN的核包膜破裂。(F)IF用抗體進行Lamin A/C和EEA1染色。(G)CTRL表示轉染了擾亂shRNA序列的OVCAR-5細胞。密度分析在柱狀圖中定量。(I)對CD63進行IP實驗的OVCAR-5細胞樣品用2%瓊脂糖凝膠電泳分析,并用溴化乙錠染色顯示DNA。(J)CTRL-IP表示用通用磁性Co-IP試劑盒中的陰性對照免疫球蛋白G(Ig G)處理的OVCAR-5細胞(54002,活性基序)。

5.臨床標本中nExo的檢測
   為了探討Nexo的臨床相關性,從HGSC患者的血漿和腹水中分離出外泌體,以表征它們的外泌體內含物(圖6,A和B)。由于超速離心分離的人血清外切體中存在豐富的免疫球蛋白污染,采用尺寸排阻色譜對這些外泌體進行純化,然后進行MS蛋白質組分析。MS分析表明,在患者來源的外泌體中鑒定的總蛋白中,3.2%至3.6%是核蛋白(圖6,C和D)。在人類腫瘤組織中也檢測到MN,分析的每個腫瘤中微核細胞的患病率為1%(圖6,E和F)。使用流式細胞術,<1%的外泌體含有gDNA,這與我們的活體小鼠模型數據一致(圖3I)。對晚期HGSC患者樣本的WGS分析顯示,在腹水來源的腫瘤和nExos中都發現了43個基因突變。這些突變的基因中有幾個參與DNA修復,例如DROSHA,LIG4,MACROD2,SATB1,RASSF6和BIRC2(圖6H)。此外,根據讀取計數的結果,外泌體中的絕大多數DNA起源于基因組而不是線粒體,并且突變特征相似(圖6I)。此外,腹水外泌體具有與原發腫瘤相似的CNV,但血漿外泌體沒有(圖6J)。

圖六 臨床標本中nExo 的檢測。(C和D)核組分以紅色高亮顯示。(C)“其他”包括細胞骨架、線粒體、核糖體和液泡。(D)“其他”包括線粒體、細胞核、細胞器腔、核糖體和液泡。(E)黑色箭頭表示MN。(F)每個點表示一個用于分析的視圖。n=4。(H)樣品取自HGSC患者。43個重疊基因中包括DROSHA、LIG4、MACROD2、SATB1、RASSF6和BIRC2。(I)所有三例患者均為晚期HGSC患者。(J)概況顯示體細胞染色體獲得(上)和丟失(下),以及正常的多態性。