circRNA在基因表達調控中發揮重要作用，可作為疾病的生物標志物。circRNA表達異常已在不同的病理過程中被發現，包括肝癌、膀胱癌、肺癌和口腔癌的發病機制。已有報道m6A修飾廣泛存在于circRNA中。但m6A修飾對circRNA的影響與調控機制及其在腫瘤進展中的生物學意義尚不清楚。Nature Communications雜志發表了一篇circRNA m6A修飾的文章“N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis”，文章報道發現m6A修飾的circNSUN2可結合YTHDC1并促進其出核，進一步結合IGF2BP2穩定HMGA2 mRNA的穩定性，從而促進結直腸肝轉移。
結果：
1.circNSUN2的表達分析
   我們使用兩對CRC和鄰近非腫瘤組織樣本進行高通量circRNA微陣列。在這些基因組位點中，我們鑒定出38種調節異常的circRNA。其中，我們進一步選取9個有統計學意義且循環失調的環狀circRNAS作為候選（圖1a）。其中4種circRNA在超過75%的標本中呈現出高表達的趨勢（圖1b）。另外，ircNSUN2高表達的組生存狀況顯著低于低表達組（圖1c）。而且與正常結直腸組織和腺瘤對照組相比，原發性CRCs中特別是LM的CRCs中circNSUN2表達顯著上升（圖1d）。此外，我們比較了從相同患者手術獲得的原發性CRCs （PC）和匹配的LM組織中circNSUN2的表達，發現與原發性CRCs組織相比，在LM組織中circNSUN2的表達顯著增加（圖1e）。與對照組的CRCs患者相比，患有LM的CRCs患者的血清circNSUN2表達也顯著升高（圖1f）。

2.CRCs中circNSUN2的鑒定
   我們通過RT-PCR、Sanger測序、RNase R處理和northern blot對HCT116細胞中的circNSUN2進行分析。經擴增引物RT-PCR檢測，序列產物與circNUSN序列一致（圖2a）。對RNase R外切酶的耐消化性證實，該RNA物種具有環狀RNA結構（圖2b）。然后，我們使用探針來區分circNSUN2及其宿主基因NSUN2（圖2c）。經轉錄抑制劑actinomycin d處理后，qRT-PCR分析顯示，circNSUN2的半衰期超過24小時，而相關線性轉錄物的半衰期約為4小時（圖2d），說明circNSUN2在CRC細胞中更加穩定。進一步的核質分離（圖2e）和熒光原位雜交（圖2f）檢測顯示，circNSUN2主要分布在胞質中。這些結果共同揭示了circNSUN2是CRC中表達豐富而穩定的circRNA。

3.circNSUN2促進CRC轉移
   鑒于circNSUN2在CRC侵襲性中的重要臨床意義，我們研究了circNSUN2在CRC細胞轉移中的體內功能。結果表明，在PDX CRC細胞中，circNSUN2表達下調后，無論是在肝臟（圖3a）還是肺（圖3c）轉移模型中，腫瘤轉移均受到明顯抑制。相比之下，通過過度表達circNUSN2注入TC71細胞的裸小鼠與對照組相比，肝臟（圖3b）或肺（圖3d）的轉移性結節明顯增多。

4.YTHDC1促進m6A修飾的circNSUN2的細胞質輸出
   為了探索circNSUN2調控CRC惡性腫瘤的潛在分子機制，我們首先進行了RNA下拉實驗和質譜分析來篩選與circNSUN2相互作用的蛋白（圖4a）。我們驗證了YTHDC1和IGF2BP2是推測的circNSUN2結合蛋白。進一步的RNA結合蛋白免疫沉淀實驗表明，與對照相比，使用YTHDC1抗體沉淀的復合物中circNSUN2富集（圖4b）。由于YTHDC1是已知的m6A讀碼器，我們想知道circNSUN2是否含有m6A甲基化。通過甲基化RNA免疫沉淀分析，我們發現circNSUN2的外顯子5和外顯子4連接序列在m6A的析出分數中得到了高度富集（圖4c），證實了circNSUN2中的m6A修飾。序列分析預測到了circNSUN2中存在GAACU motif，通過突變實驗我們發現，當RNA探針中GAACU m6A基序或YTHDC1的m6A結合基序發生突變，YTHDC1與circNSUN2的相互作用能力下降（圖4e）。此外，核質分離（圖4f）和FISH（圖4g）表明，YTHDC1的沉默顯著增加了細胞核circRNA的含量。YTHDC1野生型（WT）的強迫表達挽救了circNSUN2的細胞質輸出缺陷。總之，這些結果證明YTHDC1可以與circNSUN2結合，從而促進circNSUN2以m6A依賴的方式從 細胞核向細胞質輸出。

5.circNSUN2通過CAUCAU與IGF2BP2相互作用
   從RNA下拉實驗中，我們首先觀察到circNSUN2被大量的IGF2BP2蛋白下拉（圖5a），進一步的RNA免疫沉淀證實了IGF2BP2與circNSUN2之間的相互作用（圖5b）。通過免疫熒光和熒光原位雜交檢測，我們證實了胞質中內源性表達的circNSUN2和IGF2BP2的共域化（圖5c）。這些結果表明circNSUN2/IGF2BP2在細胞質中形成了RNA蛋白復合物。另外，我們研究了IGF2BP2與circNSUN2相互作用的結構域。RIP分析（圖5d）顯示，IGF2BP2的KH3-4-di-domain特異性地與circNSUN2結合。之前已報道IGF2BP2結合RNA的motif是CAUH （H = A、U或C），在circNSUN2中存在該基序，于是基于位點突變前后EMSA分析，我們驗證了circNSUN2內的CAUCAU是IGF2BP2相互作用所必需的（圖5e）。我們的數據揭示了IGF2BP2通過KH3-4–di-domain與circNSUN2的CAUCAU結合。

6.circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2復合物促進HMGA2 mRNA穩定
   由于IGF2BP2對mRNA的穩定性至關重要，我們接下來想知道circNSUN2/IGF2BP2復合物是否能穩定某些未知的下游靶點。因此，我們設計了干擾circNSUN2前后分析轉錄組的差異情況，644個mRNA表達在circNSUN2沉默后顯著下降。據報道，IGF2BP2優先與AU含量高的靶mRNAs的3’UTR結合。基于已發表的CLIP數據分析了這644種mRNA的情況，其中有21種mRNA可以結合IGF2BP2。考慮到circNSUN2促進了轉移進程，結合qRT-PCR和WB驗證，我們證實了HMGA2是circNSUN2的靶點。RNA下拉實驗證實了circNSUN2和HMGA2之間的相互作用（圖6a）。干擾circNSUN2后HMGA2的mRNA穩定性顯著降低（圖6b）。熒光素酶報告基因實驗、免疫熒光-FISH共定位分析和circNSUN干擾證明了circNSUN2在促進IGF2BP2與HMGA2相互作用方面起著關鍵作用，并通過形成circNSUN2/ IGF2BP2/HMGA2 RNA蛋白三元復合物來提高HMGA2的 mRNA穩定性（圖6c-f）。

7.circNSUN2通過HMGA2途徑促進CRC肝轉移
   我們研究circNSUN2在CRC轉移中的作用是否依賴于HMGA2。體內模型表明，干擾circNSUN2可抑制肝轉移，但同時過表達HMGA2則促進肝轉移（圖7a-e）。另外，為了揭示circNSUN2在CRC中的臨床相關性，我們檢測了97例CRC患者中circNSUN2和HMGA2的表達水平。我們發現HMGA2的表達水平與circNSUN2的轉錄水平呈正相關（圖7f）。接下來我們又檢測了20例CRC患者原發性和肝轉移組織中HMGA2的表達水平。結果顯示，HMGA2的表達上調在肝轉 移中比在原發性組織中更為普遍（圖7g）。

結論：
circNSUN2與細胞核內m6A結合蛋白YTHDC1結合，并且YTHDC1以m6A依賴的方式調控circNSUN2的出核定位。同時發現胞漿circNSUN2可與RNA結合蛋白IGF2BP2結合，并能直接結合下游HMGA2 mRNA，形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復合物，促進HMGA2 mRNA穩定性。進一步通過體內裸鼠轉移及體外細胞功能實驗，證明了circNSUN2通過促進HMGA2mRNA的穩定性進而最終促進結直腸癌腫瘤的肝轉移。