非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要組織學類型,約占80-85%,其中肺鱗狀細胞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)是主要的亞型,最近,針對特定基因突變的靶向藥物的開發(fā)極大地改善了晚期LUAD患者的治療,,由于鉑類化療對LUSC的療效降低所致,一小部分的LUSC港驅動基因突變,導致5年生存率低于5%。因此深入探索LUSC發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找治療LUSC的潛在分子靶點變得尤為重要。近年來,circRNA作為一種新型的調控RNA分子,引起了廣泛的關注,隨著對其結構和功能深入認識,發(fā)現(xiàn)circRNA在人類疾病(動脈粥樣硬化血管疾病、神經(jīng)疾病、心臟病和癌癥)等疾病中起重要作用。circRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)在多種類型癌癥中發(fā)揮功能,在肺癌中,LUAD相關的circRNAs被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),但是,尚未全面探討circRNA在LUSC中的作用和機制。
7月份,覃文新研究員課題組與姜麗巖教授團隊合作發(fā)表一篇“circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.”的SCI文章,IF= 11.878。該研究在五個LUSC病人標本中研究了circRNA和mRNA的表達譜,鑒定circTP63在LUSC中顯著上調,進一步發(fā)現(xiàn)circTP63與LUSC病人的腫瘤大小和TNM分期呈正相關,而且體內(nèi)外功能實驗表明circRNA過表達促進LUSC細胞的周期進程和增殖。機制上,發(fā)現(xiàn)circRNA充當ceRNA來上調FOXM1來促進細胞增殖,競爭性結合miR-873-3p,進而破壞miR-873-3p對其靶基因FOXM1的抑制作用,從而FOXM1表達上調,進而促進其下游分子CENPA和CENPB的表達,最終影響細胞周期和增殖。簡言之,該研究首次發(fā)現(xiàn)circTP63 通過ceRNA的機制驅動LUSC的發(fā)生發(fā)展,為LUSC的治療提供了新策略。
技術路線:
一、篩選肺鱗癌關鍵環(huán)狀RNA分子-circTP63
通過q-PCR實驗證實了circTP63在肺鱗癌組織中明顯上調,而且circTP63的表達與TB63表達呈正相關。顯然circTP63在LUSC中上調,重要的是, circTP63在LUSC組織與LUSC患者腫瘤較大小和更高的TNM分期呈正相關,并且其調節(jié)與以后的臨床階段相關。
二、肺鱗癌細胞中circTP63的鑒定
circTP63來自TP63基因的外顯子10至11,長度為295 nt。Northern印跡實驗證明circTP63在295nt位置。circTP63轉錄本的半衰期超過24小時,比TP63更穩(wěn)定(圖 2d)。circTP63轉錄本偏好在細胞質中(圖 2e)。在六個LUSC細胞系和兩個人類正常肺細胞系中的內(nèi)源性circTP63表達。我們發(fā)現(xiàn)circTP63在LUSC細胞系中上調相比于人正常肺細胞系(補充圖 3a)。基于此結果,選擇SW900和H1703細胞用于circTP63功能喪失檢測,而選擇H226和H2170細胞進行功能增益檢測。這些結果進一步證實了circTP63作為circRNA 的特征。
三、體內(nèi)外功能實驗證明circTP63促進腫瘤細胞的增殖和生長。
A和b. circTP63基因沉默后與過表達后qRT-PCR表明TP63的表達不受circTP63的影響;c和d. circTP63沉默或過表達后表明circTP63促進細胞增殖;e和f. circTP63沉默或過表達后表明促進細胞周期;g和h. circTP63沉默和過表達后表明circTP63增加腫瘤體積和重量。這些發(fā)現(xiàn)表明, circTP63可能在體外和體內(nèi)在LUSC中發(fā)揮致癌作用。
四、circTP63在肺鱗癌中的分子機制。
A和B.circTP63和mRNAs共表達網(wǎng)絡圖,發(fā)現(xiàn)了25個潛在的mRNA參與肺鱗癌的發(fā)展,其circTP63中FOXM1,KIFI8B和BRCA1是預測前三共表達的mRNA,而且在LUSC中FOXM1是明顯上調8倍多。C.進一步確認了上調水平35個配對LUSC樣品中的FOXM1的表達。D. 與KIF18B或BRCA1相比,circTP63的表達與FOXM1正相關.E. OXM1的八個成對LUSC樣品的蛋白水平,然后用的轉錄水平的相關性的分析circTP63表明,F(xiàn)OXM1在LUSC組織顯著上調并與正相關circTP63。F.通過qRT-PCR和Western blots驗證了circTP63沉默明顯降低FOXM1 mRNA和蛋白的表達水平,同時FOXM1沉默和過表達明顯影響細胞的生長和細胞的周期發(fā)展,因此作者說明circTP63可能通過靶向FOXM1調控LUSC細胞的增殖。
五、circTP63調控FOXM1的表達。
作者通過生信分析構建circTP63-miRNAs-FOXM1網(wǎng)絡圖,發(fā)現(xiàn)circTP63和FOXM1的共同結合位點。為了進一步證實circTP63可以作為ceRNA來調節(jié)FOXM1的表達,我們通過拷貝數(shù)測量了LUSC細胞系中circTP63和miR-873-3p的絕對表達水平。結果顯示,在大多數(shù)測試的LUSC細胞系中,circTP63的絕對表達量遠高于miR-873-3p(補充圖 6d),這表明circTP63對海綿miR-873-3p是合理的。然后,我們使用生物素偶聯(lián)的miR-873-3p模擬物進行了下拉實驗,以檢測circTP63和FOXM1的競爭結合活性到的miR-873-3p在H2170細胞。我們注意到,的近三倍富集circTP63和的近6倍富集FOXM1在的miR-873-3p捕獲分數(shù)與陰性對照相比熒光酶實驗分析表明miR-873-3p顯著性降低circTP63的熒光活性表達,并且RIP也顯示下拉的分子中富含大量的circTP63。利用RNA pull down驗也發(fā)現(xiàn)circTP63和FOXM1復合物富集大量的miR-873-3p,過表達miR-873-3p同系物顯著降低circTP63和FOXM1熒光素酶活性。circTP63充當ceRNA吸附miR-873-3p上調FOXM1的表達,影響肺鱗癌發(fā)展。
六、circTP63促進肺鱗癌細胞的周期發(fā)展。
FOXM1是細胞周期調節(jié)器,控制細胞從G1期到S期以及到M期轉變的過程。作者選擇了FOXM1可能的8個下游靶基因,通過q-PCR檢測到circTP63過表達時CENPA、CENPB和CCNB1顯著性上調,回補實驗和表型實驗都證實了CENPA和CCNPB能夠影響細胞的增殖。