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m6A甲基化與肥胖治療

欄目:最新研究動態 發布時間:2019-12-18
m6A在脂肪發生過程中起著重要作用。然而,其機制在很大程度上仍不清楚......

   m6A在脂肪發生過程中起著重要作用。然而,其機制在很大程度上仍不清楚。在這里,小編與大家分享一篇近期發表于AUTOPHAGY的文章“m6A mRNA methylation controls autophagy and adipogenesis by targeting Atg5 and Atg7”。我們證明了m6A通過靶向Atg5和Atg7在調控自噬和脂肪生成方面發揮著關鍵作用。機制上,眾所周知的m6A去甲基酶FTO的下調降低了ATG5和ATG7的表達,導致自噬體形成的衰減,從而抑制了自噬和脂肪生成。

結果:
1.FTO促進自噬,進一步促進脂肪生成

   為了探索FTO在自噬中的作用,我們首先對3T3-L1細胞進行了功能缺失的研究。western blot實驗表明,與對照細胞相比,FTO沉默顯著降低了LC3-II:I比值,增加了SQSTM1水平,表明自噬體形成缺乏穩態(圖1A)。相反,HA標記的FTO過表達顯著提高了LC3-II:I比值,減少了SQSTM1表達,表明FTO與自噬呈正相關。此外,免疫熒光檢測顯示,HA-FTO過表達后形成較多的LC3小點(圖1B,C)。我們用透射電鏡分析了脂肪形成過程中自噬體的形成。發現FTO的沉默降低了自噬體的數量,表明自噬的激活程度降低。相反,FTO的過表達增加了細胞內自噬體的數量(圖1D,E)。為了確定自噬是否受FTO過表達的影響,對照組和過表達的細胞分別使用或不使用其他自噬抑制劑治療。這進一步證實FTO促進自噬激活(圖1F,G)。
為了探討FTO是否通過自噬途徑影響脂肪生成,在脂肪生成過程中,對照組和FTO過表達的3T3-L1和豬前脂肪細胞分別使用或不使用自噬抑制劑。我們觀察到3-MA和 Baf A1治療可以逆轉增強的自噬,脂肪形成和FTO過表達細胞的甘油三酯積累(圖1H-J)。與表型一致,脂肪細胞標記的mRNA和蛋白水平包括Pparg,Fabp4和Cebpa在FTO過表達細胞明顯升高,通過3-MA或Baf A1處理可將FTO下調至正常水平(圖1K,L)。這些結果表明FTO通過促進自噬促進脂肪細胞分化。


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2.FTO的下調降低了ATG5和ATG7的表達,但沒有降低ULK1的表達
   
為了確定自噬中FTO的潛在靶基因,我們首先利用qPCR分析比較FTO敲低后自噬相關基因的mRNA表達情況。結果顯示,在FTO敲除后,Atg5和Atg7的mRNA水平顯著降低,而Ulk1沒有變化(圖2A)。另外,FTO的下調顯著下調了ATG5和ATG7蛋白水平。相反,我們發現ULK1和其他自噬相關蛋白,如ATG12和ATG16L1,并沒有發生顯著的變化(圖2B)。此外,我們檢測了ATG5和ATG7在脂肪細胞分化過程中的表達譜,發現他們兩個都在早期增加,然后下降(圖2C)。這些數據表明,Atg5和Atg7可能是FTO的靶基因。
為了檢測ATG5和ATG7對自噬和脂肪生成的影響,我們分別用ATG5和ATG7 siRNA處理3T3-L1前脂肪細胞,并使用western blot檢測其敲除效率。結果表明,LC3II:I的比值在ATG5和ATG7基因敲除后下降,FTO蛋白表達未發生變化(圖2D,E),這與FTO與ATG5、ATG7的上游下游關系一致。此外,我們發現,與對照組相比,FTO、ATG5和ATG7的缺失均顯著抑制脂肪生成和甘油三酯積累(圖2F-H)。而且FTO、ATG5或ATG7敲低均下調了脂肪細胞標記基因的表達水平(圖2I,J)。這些結果表明ATG5和ATG7對3T3-L1前脂肪細胞的自噬和脂肪生成具有重要的功能。因此,我們將重點放在這兩個FTO的潛在目標Atg5和Atg7上進行進一步的研究。

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3.FTO通過靶向ATG5和ATG7影響自噬和脂肪生成
   
為了證實FTO是否通過影響ATG5和ATG7的表達而影響自噬和脂肪生成,我們首先驗證了FTO的過表達顯著提高了ATG5和ATG7的mRNA水平(圖3A)。接下來,我們進行了搶救實驗,觀察到沉默ATG5可以逆轉FTO過表達3T3-L1細胞中上調的LC3-II:I比值(圖3B)。與ATG5相似,ATG7缺失也恢復了擴增的LC3-II:I比值(圖3C),表明FTO通過調控ATG5和ATG7表達影響自噬。已有研究報道,ATG5和ATG7在前脂肪細胞中的下調通過抑制PPARG和CEBPA的表達,抑制自噬,降低CEBPB的水平,阻礙脂肪分化計劃的啟動。這增加了FTO通過Atg5和Atg7-Cebpb信號調控脂肪生成的可能性。如我們所料,我們發現FTO的強制表達促進了CEBPB蛋白的表達,而ATG5和ATG7的缺失則逆轉了CEBPB的表達(圖3D)。此外,敲低ATG5 和ATG7可恢復FTO過表達促進的3T3-L1細胞的脂肪生成和甘油三酯積累(圖3 E-G)。FTO過表達細胞中Pparg、Fabp4和Cebpa 的表達水平的升高也被逆轉(圖3H,I)。總的來說,FTO通過介導Atg5和Atg7-Cebpb信號軸促進脂肪生成。

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4.FTO以m6A依賴的方式調控ATG5和ATG7表達
   為了進一步闡明FTO在自噬調控中的潛在分子機制,我們構建了野生型(FTO- wt)和催化突變體FTOR96Q (FTO- mut)質粒,以確定是否需要FTO的去甲基酶活性。液相色譜串聯質譜證實FTO-WT或FTO-MUT異位表達對細胞m6A水平的影響(圖4A)。體外表達的FTO-WT顯著增加了3T3-L1和豬脂肪細胞的LC3-II:I比值(圖4B),這意味著FTO以去甲基化酶活性依賴的方式調節自噬。一致的是,表達FTO-WT的細胞在免疫熒光檢測中顯示LC3斑點顯著增強(圖4C,D)。此外,與FTO-MUT或空載體相比,FTO-WT的異位表達增加了自噬體的數量(圖4E,F)。這些結果表明,FTO的去甲基化活性是前脂肪細胞自噬所必需的。接下來,我們研究了FTO是否通過去甲基化影響ATG5和ATG7的表達。與FTO-MUT或空載體相比,體外表達的FTO-WT增加了ATG5和ATG7的蛋白和mRNA水平(圖4G)。另外,在Atg5和Atg7的3’UTR處發現m6A修飾(圖4I)。我們發現,通過敲低FTO可以增加3T3-L1和豬前脂肪細胞的m6A水平(圖4J)。此外,MeRIP-qPCR檢測顯示,FTO敲除顯著提高了Atg5和Atg7 mRNA轉錄本的m6A水平(圖4K)。我們用RIP-qPCR,觀察到Atg5和Atg7分別與3T3-L1中HA標記的FTO和豬前脂肪細胞中FLAG標記的FTO相互作用,提示Atg5和Atg7是FTO的直接靶點(圖4L)。更重要的是,為了評估m6A對靶標mRNA的修飾是否對FTO介導的基因調控是必要的,我們對3T3-L1細胞進行了雙熒光素酶報告基因和誘變實驗。FTO-WT的強制表達顯著促進了Atg5和Atg7的野生型3’UTR片段的活性(圖4M)。當m6A位點發生突變時,這種增加被消除,說明FTO通過m6A依賴方式調控ATG5和ATG7的表達。此外,染色分析顯示,FTO- WT促進脂肪細胞分化和甘油三酯積累(圖4N,P),證實FTO的去甲基化活性是脂肪生成所必需的。

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5.YTHDF2通過m6A依賴機制介導ATG5和ATG7的穩定性和表達
   
為了進一步解釋m6A甲基化與FTO靶基因蛋白豐度之間的負相關關系,我們首先研究了ATG5和ATG7的表達是否受到YTHDF2或YTHDF1的影響。與對照組相比,YTHDF2的過表達顯著降低了ATG5和ATG7蛋白水平(圖5A)。而YTHDF1的強制表達對ATG5和ATG7的表達無影響(圖5B),說明ATG5和ATG7是YTHDF2的靶點。另外,通過RIP-qPCR檢測,我們進一步證實了Atg5和Atg7在3T3-L1和豬前脂肪細胞中都與標記為FLAG的YTHDF2相互作用(圖5C)。接下來,我們測試了Atg5和Atg7 mRNA上的m6A修飾是否對YTHDF2介導的基因調控至關重要。雙熒光素酶檢測顯示異位YTHDF2顯著下調攜帶野生型Atg5和Atg7片段的熒光素酶活性(圖5D)。為了研究YTHDF2是否通過介導mRNA的衰減來控制Atg5和Atg7的表達,我們對3T3-L1細胞進行了功能缺失研究。與對照細胞相比,YTHDF2的敲低提高了Atg5和Atg7的mRNA水平(圖5E)。mRNA穩定性分析顯示,YTHDF2的缺失延長了Atg5和Atg7 mRNA轉錄本的半衰期(圖5F)。此外,通過強制表達YTHDF2,可以部分逆轉FTO過表達3T3-L1時ATG5和ATG7蛋白水平的升高(圖5G)。YTHDF2過表達也部分逆轉了FTO過表達細胞中LC3-II:I比值的升高。此外,異位表達YTHDF2可以逆轉FTO過表達導致的脂肪生成和甘油三酯積累(圖5H-J)。



6.FTO可降低小鼠白色脂肪量,抑制ATG5和ATG7依賴的自噬
   為了研究FTO在體內脂肪組織中的作用,我們將Ftoflox/flox小鼠與Fabp4-Cre小鼠雜交,建立了脂肪選擇性FTO敲除小鼠(FTO-ako)模型。FTO-ako小鼠的白色脂肪組織中FTO的表達被有效地刪除(圖6A)。與胎鼠對照小鼠相比,fto-AKO小鼠不受普通飼料或高脂飲食(HFD)誘導的體重增加的影響,而兩組之間的食物攝入量沒有顯著差異(圖6B,C)。與對照組小鼠相比,fto-AKO小鼠取食普通食物和高脂飲食上都明顯變瘦(圖6D)。另外,fto-AKO小鼠的腹股溝脂肪和性腺脂肪墊的質量分別顯著低于對照組小鼠(圖6E,F)。haematine和伊紅染色顯示,取食HFD的小鼠脂肪細胞具有典型的結構,幾乎整個細胞被一個大的脂滴所占據(圖6G,H)。相反,FTO缺乏會導致多腔和較小的脂肪細胞。此外,喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平明顯低于對照組小鼠(圖6I,J)。為了研究FTO是否影響體內自噬,我們首先檢測了對照組和FTO-ako小鼠WAT中LC3-II:I和SQSTM1的表達水平。有趣的是,脂肪選擇性缺失的Fto顯著減弱了LC3-II:I比值,增加SQSTM1蛋白豐度(圖6K)。與體外研究一致,FTO缺乏減少ATG5和ATG7的蛋白和基因表達(圖6K,L)。綜上所述,這些結果表明,脂肪細胞選擇性敲除fto可以降低WAT的量,并抑制ATG5和ATG7依賴的小鼠自噬。


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總結:
   我們的研究表明,FTO在m6A-YTHDF2依賴機制中,在促進自噬和脂肪生成方面發揮著重要作用。我們的研究強調了m6A甲基化機制在自噬中的功能的重要性。這些發現為FTO和m6A修飾調節自噬和脂肪生成的分子機制,以及預防和治療肥胖的治療策略的發展提供了深入的了解。