桂林醫科大學附屬醫院胃腸科的Liyan Wang，2019 年7月發表在Molecular Cancer 的一篇文章，IF=10.679。因為越來越多的證據表明non-coding RNAs與癌癥進展之間存在密切關系。最近發現的non-coding RNAs的新成員circRNAs被證明參與多種生物過程，如發育、穩態維持和病理反應。circRNAs在癌癥中的作用近來受到廣泛關注。目前為止，circRNAs在肝細胞癌(HCC)中的表達模式和作用很大程度的基本未知。

技術路線：

結果:
一、CircRHOT1 在HCC組織中過度表達

為了確定在肝細胞癌組織中表達至關重要circRNAs，研究者分析關于HCC組織中circRNAs分布的數據庫。發現許多circRNAs在HCC組織相比癌旁組織中過度表達(圖1a)。研究者通過PCR和RNA測序來測定100對HCC組織和癌旁組織中的circRHOT1水平。結果發現，在腫瘤組織中circRHOT1顯著上調(圖1b)。選擇5對HCC組織樣本進行northern blot驗證，結果顯示circRHOT1在腫瘤組織中顯著過表達(圖1c)。進一步使用生物素標記特異性探針的原位雜交(ISH)和熒光原位雜交(FISH)檢測circRHOT1的表達。結果顯示，HCC組織中存在更多的circRHOT1(圖1d,e)。采用qRT-PCR檢測了不同分期HCC組織中circRHOT1的表達情況，結果顯示第三階段組織中的表達比第一/第二階段樣品中的高(圖 1f)。此外，在晚期HCC組織中的表達高于早期HCC組織(圖 1g)。通過Kaplan–Meier生存分析，研究者發現HCC患者的circRHOT1表達較高，預后較差(圖 1h, i)。綜上所述，研究者的數據表明，circRHOT1在HCC組織中高度表達，并與不良預后相關。

圖1 CircRHOT1 在HCC組織中過度表達。a HCC組織中上調circRNA的熱圖。在這兩個群體中，circRHOT均顯著上調和保守。b 100對HCC患者癌癥組織及癌旁組織中circRHOT的相對表達水平。c使用5對HCC樣本通過northern blot分析circRHOT表達。（P表示腫瘤周圍；T表示腫瘤。）使用backsplice連接探針檢測到circRHOT1。使用RHOT1特異性探針檢測RHOT1 mRNA。18S是加載對照，用于18S檢測的RNA樣品未用RNA酶處理。d,e用原位雜交(d)和核酸熒光原位雜交(e)使用HCC樣本#1和#4。ISH用比例尺為50 μm，FISH用比例尺為10 μm  f用qRT-PCR檢測HCC不同臨床階段標本中circRHOT的表達。g用qRT-PCR檢測腫瘤、早期HCC和晚期HCC中circRHOT的相對表達水平。 h,i 100對HCC樣本根據circRHOT表達式分為高組和低組。Kaplan–Meier生存率分析，以確定總生存率(h)和無復發生存率(i)。 * p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數據代表至少三個獨立的實驗，并以平均值SD表示

二、CircRHOT1 基因敲除抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲，促進了細胞凋亡。

我們通過CRISPR / Cas9技術敲除circRHOT1右側區域＃3，構建了circRHOT1缺失 HCC細胞系。通過PCR，Northern blot和qRT-PCR（圖2a）證實了。circRHOT1缺失不影響RHOT1 mRNA和蛋白質的表達。然后進行了CCK-8、集落形成和EdU摻入試驗，以評估circRHOT1對細胞增殖的影響。如圖所示，circRHOT1敲除顯著抑制細胞增殖、集落形成和EdU摻入(圖2b-d)。 Transwell分析發現circRHOT1基因敲除顯著抑制了HCC細胞的遷移和侵襲(圖2e，f)。此外，circRHOT1缺失顯著促進凋亡細胞百分比(圖2g)，通過檢測Caspase 3/7活性進一步證實(圖2h)。為了進一步驗證circRHOT1對HCC細胞的影響，研究者使其在HCC細胞系中的表達沉默。CCK8、集落形成、EdU摻入、Transwell和FACS的功能性實驗結果也表明，circRHOT1敲低抑制了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，但促進細胞凋亡。用野生型小鼠和缺失circRHOT1的HCC細胞進行異種移植實驗檢測功能性。如圖2i所示. circRHOT1基因敲除顯著降低了腫瘤的重量。此外，用circRHOT 1低表達或高表達HCC細胞的異種移植實驗表明circRHOT 1過表達促進體內腫瘤生長(圖2j)。總之，circRHOT1促進了HCC的發展。

圖2 CircRHOT1 基因敲除抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲，但促進凋亡。a用qRT-PCR分析了circRHOT 1基因敲除的HCC細胞中circRHOT 1的表達。b-d用CCK-8(b)，集落形成(c)和EdU摻入試驗(d)測定circRHOT1對HCC細胞增殖的影響。e,f通過transwell試驗評估了circRHOT1對侵襲（e）和遷移（f）的影響。g膜聯蛋白V/PI染色，流式檢測HCC細胞凋亡。h通過使用Caspase 3/7活性細胞凋亡檢測試劑盒測量Caspase 3/7活性。i將野生型和circRHOT1缺失的HCC細胞皮下注射到裸受體小鼠中。四周后，測量腫瘤重量。j將circRHOT1低和高表達的HCC細胞皮下注射到裸受體小鼠中。四周后，測量腫瘤重量。 * p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數據代表至少三個獨立的實驗，并以平均值SD表示
三、CircRHOT1 調節HCC細胞中NR2F6的表達

RNA測序分析了在circRHOT1缺失后差異表達的基因，發現被下調的基因中NR2F6在HCC細胞中具有較高表達值且最顯著下調(圖3a)。基于倍數變化和表達水平選擇了7個下調基因，通過qRT-PCR驗證RNA測序結果（圖3b）。蛋白質印跡顯示NR2F6蛋白水平在circRHOT1缺失的HCC細胞中顯著降低，circRHOT1主要分布在細胞核中(圖1d，e)。為了確定circRHOT1是否調節NR2F6轉錄，研究者用特異性生物素標記的circRHOT1探針通過RNA純化(CHIRP)進行染色質分離，發現circRHOT1可以富集在NR2F6啟動子轉錄起始位點(TSS)1000 ~ 800 bp的區域(圖 3d)。此外，組蛋白活性修飾H3K27Ac的富集在circRHOT1敲除后減少，而H3K27me3的富集增加(圖3e，f)。RNApol在CircRHOT1缺失后不能與NR2F6啟動子結合(圖 3g)。此外，NR2F6啟動子在circRHOT1缺失的HCC細胞中對脫氧RNA酶消化更具抗性(圖3h)，表明circRHOT1對NR2F6啟動子是不可或缺的。試驗發現在這個區域缺失后，circRHOT1不能在NR2F6啟動子上富集(圖3I)。此外，研究者發現過表達的circRHOT1提高了NR2F6的基因水平，而結合區的缺失消除了這種效應(圖3j)。因此，circRHOT1與NR2F6啟動子相關并促進其表達。

圖3 CircRHOT1 調節HCC細胞中NR2F6的表達。a Bland-Altman不同表達基因圖(log ₂(倍數變化) > 1.5)，列出了7個選定的基因。紅色圖表示NR2F6。b qRT-PCR檢測了野生型和缺失circRHOT1的HCC細胞中大多數下調基因的表達。c蛋白質印跡檢測NR2F6的表達。d在HCC細胞中，通過使用特異性生物素標記探針的RNA純化(CHIRP)來分離染色質，評估circRHOT1在NR2F6啟動子上的富集。e-g通過WT和circRHOT1缺失的HCC細胞中的染色質免疫沉淀（ChIP）測定在NR2F6啟動子上H3K27Ac（e），H3K27me3（f）和RNA pol II（g）的富集。h通過DNAse I消化評估啟動子可及性。i敲除NR2F6啟動子中circRHOT1的結合區域，然后通過CHIRP評估circRHOT1的富集。J  在指定的HCC細胞中通過qRT-PCR測定NR2F6的mRNA水平。** p ?<0.01和*** p ?<0.001。所有數據均代表至少三次獨立實驗，并以均值±SD表示

四、CircRHOT1 與TIP60的關系

為了研究circRHOT1是否與特定蛋白合作來調節NR2F6的表達，研究者使用HCC細胞裂解物進行了RNA pull down，然后進行銀染和質譜鑒定出TIP60是一種潛在的環狀蛋白1的互作蛋白(圖4a)。此外，用TIP60過表達的HCC細胞 pull down RNA顯示生物素標記的circRHOT1沉淀標志-TIP60(圖 4b)。此外，生物素標記的探針circRHOT1可以在野生型HCC細胞裂解物中沉淀內源性TIP60(圖 4c)。此外，特異TIP60抗體在HCC細胞中富集內源性circRHOT1(圖4d)。根據FISH測定，在HCC細胞中，circRHOT1與TIP60共定位(圖4e)。RNA-EMSA分析表明，TIP60直接與circRHOT1相互作用(圖4f)。

圖4 CircRHOT1 與TIP60相關聯。a將特異性生物素標記的circRHOT1探針加入HCC裂解液中，沉淀的蛋白質通過SDS-PAGE分離，進行銀染色。通過質譜分析(MS)來鑒定環形探針通道中的差異帶。circRHOT1的反義作為對照，識別出TIP60。b使用TIP60過度表達的HCC細胞進行RNA pulldown以驗證TIP60和大約T1之間的相互作用。生物素標記的circRHOT1或反義用于沉淀標志-TIP60。c特異性生物素標記的circRHOT1探針沒有在circRHOT1敲除的HCC細胞中沉淀TIP60。d  RNA分子印跡結果表明，HCC細胞中TIP60富集約T1。e RNA熒光原位雜交(FISH)顯示，在HCC細胞中，circRHOT1與TIP60共定位。比例尺，10 μm。f RNA EMSA分析表明，TIP60與circRHOT1直接相互作用。線性circRHOT1用生物素標記。所有數據代表至少三個獨立的實驗，并以平均值SD表示

五、CircRHOT1富集TIP60來激活NR2F6表達

為了進一步確定TIP60是否參與NR2F6表達的調節，研究者用HCC細胞進行了ChIP測定。研究者發現TIP60在與NRRF1啟動子相同的區域中與circRHOT1富集（圖5a）。此外，敲除TIP60還抑制H3K27Ac和RNA pol在NR2F6啟動子上的富集(圖5b，c)。此外，TIP60缺失下調了HCC細胞NR2F6的基因和蛋白水平(圖 5d，e)。接下來，研究者想確定在TIP60介導的NR2F6表達中，circRHOT1的作用。研究者發現CircRHOT1 敲除取消了TIP60在NR2F6啟動子上的富集(圖5f)。DNA FISH還表明，circRHOT1基因敲除消除了TIP60與NR2F6啟動子的共定位(圖 5g)。重要的是，circRHOT1缺陷導致NuA4復合體的富集失敗NR2F6啟動子，而NuA4復合物結合到NR2F6對照HCC細胞中啟動子(圖5h)。此外，circRHOT1和TIP60的雙重敲除進一步抑制了HCC細胞中NR2F6的基因水平(圖1)。5I)。然后，研究者分析了HCC組織中circRHOT1、TIP60和NR2F6的表達水平之間的關系。研究者發現HCC組織中NR2F6的蛋白和基因水平與TIP60的蛋白和基因水平呈正相關。5j，k)。此外，HCC組織中NR2F6和circRHOT1的表達呈正相關(圖2)。總之，CircRHOT1 對HCC組織中TIP60介導的NR2F6表達是必需的。

圖5  circRHOT1富集TIP60以激活NR2F6表達。a ChIP實驗表明，TIP60與NR2F6啟動子在與circRHOT1相同的區域相關。b,c TIP60敲除顯著降低H2K27Ac的富集(b)和RNA pol II(c)在NR2F6啟動子上。d,e TIP60敲除能顯著抑制基因表達(d)和蛋白質水平(e)在HCC細胞中的表達。f,g RNA IP(f)和RNA FISH(g)結果表明，circRHOT1敲除抑制了HCC細胞中TIP60與NR2F6啟動子的關聯。比例尺，10 μm。h將所示的HCC細胞裂解并用1%甲醛處理進行交聯。接下來，將anti-TIP60與經處理的裂解物一起孵育，用于ChIP分析，隨后分別通過蔗糖梯度超速離心進行尺寸分級。洗脫液梯度通過蛋白質印跡和PCR檢測。i circRHOT1和TIP60雙敲除對NR2F6基因表達水平的抑制更為嚴重。j用蛋白質印跡法測定HCC組織中TIP60和NR2F6的蛋白水平。k根據GSE45436數據集，NR2F6的表達與HCC組織中的circRHOT1和TIP60的表達呈負相關。***p<0.001。所有數據代表至少三個獨立的實驗，并以平均值SD表示

六、NR2F6的恢復了circRHOT1缺失介導的HCC生長和轉移的抑制

研究發現NR2F6在HCC癌組織中與癌旁組織的表達相比上調(圖6a，b)。研究發現100對HCC樣本中NR2F6的表達在腫瘤組織中上調(圖6c)。免疫組織化學分析和蛋白質印跡證實HCC組織中NR2F6水平升高(圖6d，e)。此外，NR2F6在HCC患者中的高表達提示預后較差(圖6f)。然后研究者敲除NR2F6或恢復其在circRHOT1缺失的HCC細胞中的蛋白質水平(圖6g)。CCK-8和Transwell分析顯示敲除circRHOT1或NR2F6可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，而在circRHOT1缺失的HCC細胞中啟動NR2F6可在體外恢復細胞增殖、遷移和侵襲(圖6h-j)。體內異種移植實驗表明敲除circRHOT1或NR2F6抑制腫瘤生長。然而，NR2F6恢復了circRHOT1缺失介導的對腫瘤生長的抑制(圖6k)。因此，研究者的結果表明，circRHOT 1通過NR2F6的激活抑制HCC進程。

圖6  NR2F6的恢復了circRHOT1缺失介導的HCC生長和轉移的抑制。a.c根據GSE36376數據集(a)，GSE25097數據集(b)和qRT-PCR結果(c)與鄰近正常組織相比，在HCC組織中NR2F6 mRNA水平上調。d,e免疫組織化學分析(d)和western blotting(e)表明NR2F6蛋白水平在HCC組織中上調。f Kaplan-Meier生存分析用于評估NR2F6在HCC患者表達的預后意義。g 通過在circRHOT1敲除的HCC細胞中用異位表達質粒的NR2F6轉導來恢復NR2F6蛋白水平。h-j通過CCK-8和Transwell測定評估NR2F6對HCC細胞增殖（h），遷移（i）和侵襲（j）的影響。 k 通過異種移植測定NR2F6對體內腫瘤生長的影響。* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數據均代表至少三次獨立實驗，并以均值±SD表示
結論:
綜上所述，circRHOT1通過富集TIP60來抑制HCC的發展和進步NR2F6表達，表明circRHOT1和NR2F6可能是HCC預后的潛在生物標志物。