LncRNA與癌癥的捆綁研究已不算少見，最近，Cancer Research （IF=8.378）上發表了一篇名為“LncRNA SNHG10 Facilitates Hepatocarcinogenesis and Metastasis by Modulating Its Homolog SCARNA13 via a Positive Feedback Loop”的文章，文章的作者們通過一系列的實驗，發現了在肝癌發生和轉移過程中存在的一個復雜回路，揭示了LncRNA SNHG10是如何通過正反饋環調節其同源SCARNA13，以促進肝癌的發生和轉移的，為肝癌的治療提供了一條新的清晰思路。

摘要：
弄清非編碼RNA（ncRNA）在腫瘤發生和轉移過程中的作用可以為疾病診斷和靶向治療開辟新的途徑。本次研究以鑒別肝細胞癌（HCC）特異性ncRNA并研究其在肝癌發生和轉移過程中的作用為目標。肺轉移引起的異種移植物的RNA-seq鑒定出的長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因10（SNHG10）及其同源SCARNA13，是HCC發展和轉移的新驅動因子。在64例HCC中，SNHG10的表達與SCARNA13的表達程正相關，且SNHG10或SCARNA13的高表達與總生存期差有關。在過表達或敲除SNHG10后，SCARNA13分別表現出明顯的升高和下降，我們猜測SNHG10可能是SCARNA13的上游調控因子。SNHG10和SCARNA13協同促進HCC細胞的惡性表型，其中SNHG10充當miR-150-5p的海綿，并與RPL4 mRNA相互作用，以增強c-Myb的表達和活性。反之，c-Myb的上調和超激活通過調控SNHG10啟動子活性，形成正反饋環，持續刺激SCARNA13表達，從而增強SNHG10和SCARNA13的表達。SCARNA13介導SNHG10驅動的HCC細胞增殖、侵襲和遷移，并通過調節SOX9促進HCC細胞的細胞周期和上皮-間質轉化。總體而言，我們發現在肝癌發生和轉移過程中，SNHG10及其同源物SCARNA13的伴隨上調背后的一個復雜回路。
意義：這些發現揭示了非編碼RNA在肝細胞癌發生和轉移中的作用。
結果：

一.SNHG10和SCARNA13在肺轉移灶和HCC組織中升高，并且與HCC患者的不良預后相關
為鑒定參與HCC轉移的ncRNAs，研究者首先建立肺轉移篩查小鼠模型(圖1A)，通過RNA-seq結果與TCGA LIHC數據存儲庫的交集選擇候選lncRNA和snoRNA (圖1B，1C)。通過交叉，24個lncRNAs和6個snoRNAs被認為可能在HCC的形成和轉移中起重要作用。研究者發現在這些異常表達的基因中有SNHG10和SCARNA13，它們是同一初級RNA轉錄本的不同產物，SCARNA13是從SNHG10基因的初級RNA轉錄本的內含子加工而成的，而外顯子被剪接到SNHG10轉錄本中(圖1D)。SCARNA13的表達與SNHG10的表達具有統計學相關性(圖1E)。采用qPCR方法檢測64對HCC組織及癌旁正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達，HCC組織中SNHG10和SCARNA13水平均高于癌旁正常組織(圖1F和G)，并且二者之間存在統計學上的正相關關系(圖1H)。Kaplan-Meier分析顯示SNHG10或SCARNA13的高表達與較差的總生存率顯著相關(圖1I和J)。用qPCR方法檢測SNHG10在5種不同肝癌細胞系中的表達，與其他細胞相比，HCCLM3和SNU-387細胞的SNHG10表達相對較高(圖1K)。這些結果表明SNHG10可能是SCARNA13的上游調控因子。（數據采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01.）

二.SNHG10促進HCC細胞的形成和轉移
EDU免疫熒光染色分析結果顯示，SNHG10的損耗顯著抑制SNU-387和HCCLM3細胞周期和增殖，并誘導凋亡(圖2A和B)。Transwell侵襲試驗結果顯示SNHG10沉默極大地削弱了SNU-387和HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力(圖2C和D)。為進一步研究SNHG10對肝癌細胞的體內致瘤作用，研究者將SNU-387和HCCLM3細胞皮下注射到裸鼠體內。LV-shSNHG10組腫瘤的體積和重量均顯著低于LV-shCtrl組(圖2E-G)。構建用于肝轉移檢測的原位移植模型以評估SNHG10對肝癌細胞轉移的促進作用，與LV-shCtrl組相比，LV-shSNHG10組肝轉移結節的熒光素酶信號強度顯著降低(圖2H)，證明SNHG10增強了HCC細胞的肝內轉移能力。最后，用螢火蟲熒光素酶標記SNU-387和HCCLM3細胞，直接接種裸鼠尾靜脈進行肺轉移檢測，LV-shSNHG10組小鼠的熒光素酶信號強度明顯低于LV-shCtrl組(圖2I)，說明SNHG10可促進HCC細胞的肺轉移潛能。H&E染色顯示LV-shSNHG10組肺和肝臟組織切片中的轉移灶顯著減少(圖2J和K)。（數據采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01; *** , P < 0.001.）

三.SCARNA13促進HCC細胞的腫瘤發生和轉移
由于SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時上調，研究者們評估了SCARNA13對HCC細胞惡性表型的影響。與SNHG10相似，敲除SCARNA13極大地抑制了細胞周期和增殖，并誘導SNU-387和HCCLM3凋亡(圖3A-H)。此外，SCARNA13的下調大大削弱了SNU-387和HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力(圖3I-L)。這些結果表明SCARNA13是HCC中的致癌啟動子。

Figure 3.抑制SCARNA13阻礙HCC細胞在體外的增殖和轉移。A and B, CCK-8檢測轉染SCARNA13 ASOs或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞。C and D, 用碘化丙啶染色檢測轉染SCARNA13 ASOs或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞的細胞周期分布，并進行流式細胞術分析。E and F, 對轉染SCARNA13 ASOS或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞進行EDU免疫熒光染色分析。比例尺，100μm。G and H, 采用FITC-Annexin V和碘化丙鈉染色法檢測轉染SCARNA13 ASOs或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞的凋亡情況，并進行流式細胞術分析。 I and J, 轉染SCARNA13 ASOS或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞的Transwell侵襲試驗。比例尺，100μm. K and L, 轉染SCARNA13 ASOS或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞的傷口愈合遷移試驗。比例尺，100μm。數據采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；** , P < 0.01; *** , P < 0.001。
四、轉錄因子c-Myb上調SNHG10和SCARNA13水平
轉錄因子(TF)在識別和動態結合位于啟動子的簡并序列基序中的作用在轉錄中起著關鍵作用。研究者推測某些TF是否導致SNHG10和SCARNA13的異常表達。通過Jaspar、PROMO和LASAGNA數據庫的交集確定了9個可能與SNHG10基因的啟動子區域結合的TFs(圖4A)。對TCGA LIHC數據集的分析表明，在9個TF中，c-Myb表達與SNHG10和SCARNA13表達相關性最高(圖4B和C)。c-Myb的敲除顯著降低了SNU-387和HCCLM3細胞中SNHG10和SCARNA13的表達(圖4D和E)，c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上游調節因子。生物信息學分析預測SNHG10的啟動子區域中有5個c-Myb結合位點(MBS)(圖4F和G)。ChIP分析證實c-Myb在SNHG10啟動子區域的MBS1和MBS3上顯著高富集(圖4H)。為了進一步確定c-Myb在SNHG10基因啟動子上的轉錄激活，將SNHG10啟動子熒光素酶報告基因(pEZX-PL01-SNHG10)和靶向c-Myb的siRNA共轉染細胞。c-Myb的缺失顯著降低了HEK293T細胞中SNHG10啟動子的活性(圖4I)（數據采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；* ，P < 0.05; *** , P < 0.01; *** , P < 0.001）。這些數據表明c-Myb可以直接與SNHG10的啟動子區域結合，導致SNHG10和SCARNA13在HCC細胞中的上調。

五、SNHG10作為miR-150-5p的海綿增加c-Myb的表達
使用RNA FISH以確認SNHG10和SCARNA13的定位，發現SNHG10主要定位于細胞質，而SCARNA13優先位于細胞核(圖5A)。細胞質lncRNAs可以作為競爭內源性RNA(ceRNA)來隔離miRNAs，導致相應的miRNA靶向mRNAs的釋放。利用生物信息學分析預測SNHG10與miR-150-5p之間的結合位點。(圖5B)。RIP檢測SNU-387和HCCLM3細胞中SNHG10和miR-150-5p在Ago2上相對于IgG的富集情況，以驗證SNHG10和miR-150-5p是否參與RNA誘導的沉默復合物(RISC) (圖5C和D)。ChiRP分析在SNU-387和HCCLM3細胞中SNHG10和miR-150-5p在偶數和奇數探針池中相對于設置的對照LacZ探針的富集情況，以確定SNHG10與miR-150-5p之間的直接相互作用 (圖5E和F)。miR-150-5p mimics的轉染顯著抑制了含有全長SNHG10的pmirGLO-SNHG10在Rluc的30個UTR處的熒光素酶活性。相反，pmirGLO-SNHG10-mut(miR-150-5p)對miR-150-5p(圖5G)沒有反應。Western blot分析在miR-150-5p模擬物或抑制劑作用下的HCC細胞中的c-Myb (圖5H ，5I)。這些發現表明SNHG10作為miR-150-5p的海綿，可以降低其對c-Myb的抑制作用，從而增強c-Myb的表達。

六、SNHG10通過miR-150-5p/RPL4-c-Myb-正反饋環調節SCARNA13的表達
CARNA13是由SNHG10，miR-150-5p和c-Myb組成的正反饋環的下游效應器。
當c-Myb siRNA在RNA和蛋白質水平上完全逆轉LV-SNHG10細胞中的c-Myb上調時，SCARNA13的表達在統計學上仍高于以前，這暗示SNHG10可能不僅僅通過調節c-Myb的表達來調節SCARNA13，此后，通過進一步的挽救實驗發現，當與miR-150-5p抑制劑和c-Myb siRNA共轉染后，LV-Control細胞中c-Myb的表達在RNA和蛋白質水平上保持穩定，SCARNA13的表達沒有明顯變化(圖6A)，由此可見，c-Myb的表達水平是SNHG10過表達導致SCARNA13表達上調的部分原因。研究者推測SNHG10結合的某些mRNAs可能調節c-Myb的功能活性，因此從chirp-seq結果與BioGRID交互數據庫的交叉點中篩選出RPL4和DDB1。(圖6B)。與DDB1相比，在TCGA LIHC數據集中，RPL4與SNHG10顯示出明顯更高的相關性(圖6C和D)。Chirp法檢測在SNU-387和HCCLM3細胞中RPL4 mRNA在偶數和奇數探針池中相對于設置的對照LacZ探針的富集程度(圖6E和F)。用Dactinomycin處理SNU-387和HCCLM3細胞，以阻斷新RNA的合成，并在24小時內測量RPL4的丟失百分比。研究結果表明，SNHG10的過度表達延長了RPL4 mRNA的半衰期(圖6G和H)。研究者構建含有c-Myb識別元件(MRE)的熒光素酶報告基因以評價RPL4對肝癌細胞中c-Myb功能活性的正向調控作用。熒光素酶報告分析顯示RPL4可以增強MRE的活性(圖6I)。共免疫沉淀試驗以確定RPL4與c-Myb之間的相互作用，驗證了RPL4在抗c-Myb組中的富集程度顯著高于IgG組(圖6J)。反之，與IgG組相比，抗RPL4組的c-Myb豐度顯著增加(圖6k)。進一步的搶救實驗表明，在與c-Myb siRNA和RPL4 siRNA共轉染后，SCARNA13的表達在LV-SNHG10細胞中沒有任何統計學變化(圖6L)。這些數據表明，SNHG10一方面通過吸收miR-150-5p促進c-Myb的表達，另一方面通過與RPL4相互作用增強c-Myb的轉錄活性，從而調節SCARNA13的表達。（數據采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；* , P < 0.05; ** , P < 0.01; *** , P < 0.001.）

七、SCARNA13通過調節SOX9介導SNHG10驅動的HCC細胞增殖、侵襲和遷移
將SCARNA13 ASO轉染到LV-SNHG10細胞，EDU免疫熒光染色檢測和Transwell侵襲實驗發現敲除SCARNA13顯著挽救了SNHG10過表達對細胞增殖、侵襲和遷移的影響(圖7A和B)。通過轉錄學和蛋白質組學的交叉鑒定了11個SCARNA13的下游基因。(圖7C)。其中SOX9的表達在SCARNA13敲除后在蛋白質水平上表現出最顯著的下降。SCAR轉染SCARNA13 ASOs或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞中，SOX9在RNA和蛋白水平上的表達顯著降低(圖7D-F)。Western blot分析轉染SCARNA13 ASOs或對照組的SNU-387和HCCLM3細胞的細胞周期和EMT的分子標記(圖7G)。這些發現說明SNHG10對腫瘤發生和轉移的促進作用是通過SCARNA13介導的，SCARNA13通過上調HCC細胞中的SOX9來促進細胞周期和EMT。
（圖7H）肝癌細胞中SNHG10和SCARNA13同時上調的復雜電路的示意圖模型。（數據采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01; *** , P < 0.001）

結論：
研究者在HCC中發現了一個復雜的回路，它與肝癌中SNHG10及其同源SCARNA13的上調有關。SNHG10通過海綿miR-150-5p并與RPL4 mRNA相互作用調節c-Myb，調節HCC細胞中SCARNA13及其下游效應子SOX9的表達。