有研究表明微重力顯著引起負重骨的骨質每月流失約為1%-2%。重力是成骨細胞形成、分化以及維持骨骼組織的重要因素。人骨髓間充質干細胞(hBMSc)是成人骨髓中的一類多能干細胞。它具有增殖和分化為不同間充質組織的潛能,在正常重力作用下,hBMsc可以在特定誘導條件下分化為成骨細胞,而微重力抑制了hBMsc向成骨細胞分化。那么微重力對hBMsc分化過程中RNA表達有何影響呢?2018年11月一篇發表在《Cell Proliferation》上的《Effects of simulated microgravity on the expression profiles of RNA during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells》文章研究了微重力對人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中RNA表達譜的影響,揭示了hBMSCs在正常基因(NG)和模擬微重力(SMG)下的基因表達模式,該研究為利用基因調控手段降低微重力下人內體成骨形成和降低骨量流失提供思路。
摘要:
目的:暴露于微重力誘導人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)的許多適應性和病理學變化。但是,人們對這些變化的潛在機制了解甚少。我們揭示了hBMSCs在正常基因(NG)和模擬微重力(SMG)下的基因表達模式,并通過基因調控和信號通路分析對這些變化進行解釋。
材料和方法:在這項研究中,hBMSCs在正常地面重力和模擬微重力下成骨誘導0,2,7和14天,然后通過RNA測序分析成骨分化過程中轉錄組表達的差異以及這些結果的一些實驗驗證。
結果:分別在2,7和14天樣本中鑒定出837,399和894個差異表達基因(DEGs),其中13個基因被選擇用于qRT-PCR分析以確認RNA測序結果。經過分析,我們發現誘導早期抑制了增殖。在中期,成骨分化受到抑制,而SMG 促進脂肪分化。此外,在后期SMG導致發生腫瘤的特異性基因上調。
結論:我們的數據顯示SMG抑制成骨細胞增殖和分化,但促進脂肪形成。 SMG還選擇延長高致瘤性細胞在SMG下存活。
技術路線:
結果:
1.RNA-seq數據分析
首先,通過成對比較分別從誘導第0天(d0),第2天(NG2,SMG2),第7天(NG7,SMG7)和第14天(NG14,SMG14)的細胞獲得差異表達的基因(DEG)。DEG的類型和數量隨誘導時間而變化。
圖1 第2,7和14天的DEG和DEG的聚集。(A)DEG的維恩圖比較d0與NG2,NG2與NG7,NG7與NG14,以及d0與NG14和DEG的維恩圖比較d0與SMG2,SMG2與SMG7,SMG7與SMG14和d0與SMG14的比較。(B)NG2與SMG2,NG7與SMG7和NG14與SMG14的DEG。紅色,綠色和藍色點分別代表上調,下調和不顯著的基因。(C)熱圖顯示mRNA的轉化表達值的K均值聚類。黃色表示較高的表達,藍色表示較低的表達。(D)折線圖表示NG和SMG組中對應于熱圖的八個簇中的基因的表達模式。前四個集群在NG組中,后四個集群在SMG組中。 DEGs,差異表達的基因; NG,正常地面條件; SMG,模擬微重力; d0,細胞誘導0天; NG2,細胞在正常地面條件下誘導2天; SMG2,細胞在模擬微重力條件下誘導2 d; NG7,細胞在正常地面條件下誘導7天; SMG7,細胞在模擬微重力條件下誘導7 d; NG14,細胞在正常地面條件下誘導14 d; SMG14,細胞在模擬微重力下誘導14天。
2.GO/KEGG富集分析
首先選擇了誘導第二天的來分析成骨早期差異表達。為了便于分析,選擇了三種本體(生物過程,細胞成分和分子功能)中10種最富集的GO條目。GO分析表明,大多數富集的DEG與三種本體的細胞周期和細胞分裂有關。三種本體中最富富集的GO條目分析,大多數基因都下調。KEGG分析表明,當細胞被誘導兩天時,這些基因參與各種代謝途徑。此外還發現在分子功能中存在兩個GO條目與微管蛋白和細胞骨架相關。
圖2. GO分析三種本體中的DEGs和NG2與SMG2樣品中DEGs的途徑分析。(A)紅色,藍色和綠色分別代表生物過程,細胞成分和分子功能。(B)上調和下調基因分別從左到右富集三種本體,生物過程,分子功能和細胞成分。紅色代表上調節基因,綠色代表下調基因。(C)點的大小代表DEG的數量。 富含因子是指該途徑中富含的DEG與該途徑中所有注釋基因之間的比率。大的富集因子表示高度富集。q值越低,DEG的富集越顯著。GO,基因本體論; DEGs,差異表達的基因; NG2,細胞在正常地面條件下誘導2天; SMG2,細胞在模擬微重力下誘導2天。
緊接著為了驗證該結果,進行細胞增殖,細胞周期測定和肌動蛋白細胞骨架的免疫熒光以確定微重力的影響。在成骨誘導的0,12,24和48小時檢測細胞增殖,NG下比SMG細胞的增殖率更高。
圖3. 在NG和SMG下誘導0,12,24和48小時的hBMSC的細胞增殖和細胞周期分析。(A)在0,12,24和48小時的細胞增殖測定。實線表示在正常地面條件(NG)下誘導的細胞,虛線表示在模擬微重力(SMG)下誘導的細胞(n = 3)。 (B)在NG和SMG(n = 3)下誘導12,24和48小時的細胞G0 / G1,S和G2 / M期的百分比,以及G0 / G1,S和G2 /中細胞的百分比 在PI染色后通過流式細胞術確定M期(n = 3)。 黑色代表在NG條件下誘導的細胞,灰色代表在SMG條件下誘導的細胞。 * P <0.05,** P <0.01。hBMSCs,人骨髓間充質干細胞。
為了研究成骨的中期和后期,選擇第7天和第14天進行GO和KEGG分析。GO分析表明,大多數富集的DEG與多細胞生物體過程有關。在NG14與SMG14組中,多細胞生物體過程,受體結合和細胞外區域是所研究的三種本體中三種最富集的GO條目。對富集的前20個統計數途徑分析,觀察到富含這些途徑的基因與免疫應答,腫瘤進展,增殖,分化和信號轉導相關。
圖4. NG7與SMG7樣品中DEG的GO和途徑分析。 (A)對三種本體中DEG的GO分析。 紅色,藍色和綠色分別代表生物過程,細胞成分和分子功能。 (B)NG7與SMG7途徑富集的前20個統計數據。 點的大小代表DEG的數量。 大的富集因子表示高度富集。 q值越低,DEG的富集越顯著。 (C)前20個富集途徑的上調和下調基因。 紅色表示上調基因,綠色表示下調基因。 GO,基因本體論; DEGs,差異表達的基因; NG7,細胞在正常地面條件下誘導7天; SMG7,細胞在模擬微重力下誘導7天
圖5. NG14與SMG14樣品中DEGs的GO和途徑分析。(A)對三種本體中DEG的GO分析。 紅色,藍色和綠色分別代表生物過程,細胞成分和分子功能。(B)NG14與SMG14途徑富集的前20個統計數據。點的大小代表DEG的數量。紅色表示較小的q值,藍色表示較大的q值。 較小的q值表示更顯著的富集。GO,基因本體論; DEGs,差異表達的基因; NG14,細胞在正常地面條件下誘導14 d; SMG14,細胞在模擬微重力下誘導14天。
結論:SMG在hBMSCs成骨早期抑制細胞增殖,而在中期,它抑制向成骨細胞的分化并促進脂肪生成。