隨著第二代測序技術的發展，small RNA(包括miRNA，ncRNA，siRNA，，piRNA, tRFRNA)在疾病中的研究如雨后春筍般展開，環狀RNA相比于線性化的RNA而言circRNA表現出了非同一般的穩定性，circRNA較多的作為miRNA的海綿體（sponge）而存在，且在疾病的發生發展中發揮重要的作用。如何研究在這樣的形勢下保持嚴謹與不落俗套，建立好的疾病模型與選擇好的實驗思路尤為重要，2018年5月，上海第九人民醫院矯形外科的研究人員在Ann Rheum Dis (IF=12.35)上發表了一篇名為 “Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein”的文章。為我們在疾病模型中研究circRNA提供了很好的思路借鑒。

本文的實驗設計思路如下： miRNA差異表達→預測靶基因 mRNA→由ceRNA機制引出 circRNA→細胞模型&大鼠模型證明→疾病IVDD

機制圖

結果

1. miR-200c在退行性髓核組織（NP）中上調，參與調節髓核細胞的生存能力和功能

利用數據庫GSE45856獲得的微陣列數據，對退行性的髓核組織中miRNA的差異表達進行了研究。miRNA芯片檢測到的2672個miRNA中，有14個miRNA在退行性髓核組織中上調 (圖1A)。選擇這些候選miRNA， qRT-PCR分析驗證。miR-200c、miR-130b-5p和mir -2355 -5p在退行性NP組織中顯著上調，其中miR-200c的上調水平最高(圖1B)。這些miRNA在腰椎間盤退變（IVDD）大鼠模型中的表達模式與患者樣本一致(圖1C)。Northern blot也證實了退行性NP組織中miR-200c水平的升高(圖1D)。miR -200c過表達細胞(圖1E)顯示凋亡細胞百分比增加(圖1F)， caspase活化升高，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5表達增加，膠原蛋白II和aggrecan表達減少(圖1G)。這些結果提示miR-200c在髓核細胞中的促凋亡和促代謝效應。值得注意的是作者選擇了NP細胞（髓核細胞），一種在腰間盤最豐富的細胞類型，而且分泌多種細胞外基質+細胞因子，調控腰間盤的微環境。

2. miR-200c通過抑制其靶點XIAP調控NPC的生存能力和功能

生物信息學預測凋亡通路調控因子XIAP是miR-200c的潛在靶點(圖2A)。退行性NP組織中上調的miRNA與凋亡信號通路調控的相關性。野生型XIAP報告基因的熒光素酶信號被miR-200c抑制，而引入突變則消除了miR-200c的抑制作用(圖2B)。與對照組相比，退行性NP組織中XIAP表達減少(圖2C)。miR-200c的升高降低了XIAP的表達，而內源性miR-200c的降低增加了NPC中XIAP的表達(圖2D)。TNF-αXIAP和IL-1β治療誘導了在髓核細胞的XIAP蛋白質的減少,而mir - 200 c拮抗劑消除了這種減弱作用(圖2 E)。我們進一步研究了miR-200c和XIAP在npc中的功能是否相關。此外, 接受TNF-α和IL-1β治療時，XIAP的缺失明顯中和了mir - 200 c拮抗劑在髓核細胞中的拮抗劑作用 (圖2 F,G),表明mir - 200 c通過XIAP發揮其功能。

3. CCircVMA21充當了miR-200c的海綿

starBase預測miR-200c具有多個環狀RNA的結合位點。我們根據前20名的預測環狀RNA評分進行篩選。通過qRT-PCR分析，circVMA21在NP組織中得到驗證(圖3A)。退行性NP組織中CircVMA21水平明顯降低(圖3B)。 FISH也證實了這一結果(圖3C)。使用RNAhybrid對circVMA21與miR-200c的序列進行了比較，發現circVMA21含有6個miR-200c的假定靶點(圖3D,)。其中5個位點通過熒光素酶檢測得到驗證(圖3E)。相對于mRNA(圖3F)，該環狀RNA豐富且耐RNAse R處理。North blot分析顯示線性VMA21是通過線性探針檢測的，而不是在剪接位點的圓形探針檢測(圖3G)。pull down試驗顯示，與引入破壞miR-200c與circVMA21結合位點的miR-200c突變相比，miR-200c富集了circVMA21(圖3H)。CircVMA21來源于VMA21基因的最后一個外顯子，主要轉錄mRNA的3’UTR。我們發現它擁有69個AGO2蛋白結合位點。交聯和免疫沉淀(CLIP)序列顯示至少30個AGO2結合區域位于VMA21 mRNA的3'UTR。其中5個區域與miR-200c的結合位點重疊(圖3I)。AGO2免疫共沉淀發現內源性AGO2下調的circVMA21在轉染miR-200c的NPCs中富集，但未富集其突變體(圖3I)，提示miR-200c促進了AGO2與circVMA21之間的聯系。North blot分析顯示circVMA21可以反向拉低miR-200c(圖3J)。結果表明circVMA21能夠直接與髓核細胞中中的miR-200c結合。

4. circVMA21通過靶向miR-200c和XIAP在髓核細胞中發揮作用

腺病毒circVMA21感染導致NPCs中circVMA21過表達，siRNA抑制circVMA21表達(圖4A)。North blot分析證實了外源性circVMA21攝入后circVMA21的數量增加(圖4B)。circVMA21的上調增加了XIAP的表達，而circVMA21的下調導致了XIAP表達的降低(圖4C)。circVMA21上調抑制了miR-200c對XIAP表達(圖4D)和活性(圖4E)的抑制作用。綜上所述，這些結果表明circVMA21作為miR-200c的功能性海綿來調節XIAP的表達和活性。在炎性細胞因子治療后，qRT-PCR分析發現NPCs中circVMA21水平降低，miR-200c水平升高，均可通過上調circVMA21逆轉(圖4F,G)。因此，circVMA21的強制表達抑制了這些細胞因子的凋亡和分解代謝作用，促進了膠原蛋白II和aggrecan的表達(圖4H)。

5. 在大鼠模型中，椎間盤內注射circVMA21可以緩解IVDD

通過穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(圖5A)。在穿刺1周和5周后，腺病毒人circVMA21使用33針細針注射入穿刺的IVD中。在第1、5和9周的x光檢查顯示，所有IVD穿刺組的椎間盤間隙隨時間逐漸縮小。注射后各時間點，circVMA21組與未注射組、circVMA21-mut組椎間盤高度指數百分比(%)無顯著差異(圖5B、C)。注射9周后，circVMA21組IVDs MRI退變評分明顯低于未注射組(圖5D、E)。在體內RNA FISH發現circVMA21位于NP區域(圖5F)。注射腺病毒circVMA21后，退行性NP組織中的circVMA21水平顯著升高，miR-200c水平下降(圖5G,H)。腺病毒circVMA21的注射緩解了NP的退行性變化，增強了細胞凋亡和分解代謝反應，降低了IVDD大鼠模型中ECM的組成(圖5I,J,K,)。9周時，非注射組的組織學評分明顯高于circVMA21組(圖5L,M)。綜上所述，這些結果揭示了升高的circVMA21水平對抑制鼻咽癌凋亡、抑制ECM分解代謝、促進NP內合成代謝以及在體內緩解IVDD的積極作用。