CircRNAs是一類廣泛表達在哺乳動物細胞中的非編碼RNA。全基因組分析揭示了環狀RNA的跨物種分布，并且其特性是進化性保守的，這便進一步揭示了環狀 RNA的特定的生理角色與功能。鑒于此，加拿大多倫多大學楊柏華教授帶領他的團隊探究了circ-Dnmt1對乳腺癌的作用，并于2018年7月4日在Oncogene雜志（IF=7.5）發表了他們的研究成果，環形RNA circ-Dnmt1 通過調控p53和AUF1入核，促進細胞自噬作用。Circ-Dnmt1是DNMT1基因第6和7外顯子反向拼接形成的，作者是通過芯片分析發現乳腺癌細胞中普遍存在circ-Dnmt1高表達的現象，因此針對該分子的作用機制展開了研究。過表達circ-Dnmt1能促進細胞增殖，并且能增加對應的Dnmt1的成熟的mRNA水平，但對該基因的轉錄出產物pre-mRNA沒有影響。過表達circ-Dnmt1能促進細胞自噬，免疫熒光實驗表明p53和AUF1在circ-Dnmt1過表達后核定位增加了，RIP實驗證明了circ-Dnmt1可以與p53和AUF1相互作用。核定位的p53促進自噬相關基因的表達，而核定位的AUF1不能繼續調控Dnmt1的mRNA降解作用，導致該mRNA富集并促進DNMT1蛋白的表達。小鼠皮下腫瘤模型實驗表明過表達circ-Dnmt1顯著增加腫瘤的體積。

技術路線

結果
1. circ-Dnmt1在乳腺癌中高表達　　

圖1. 乳腺癌細胞中存在circ-Dnmt1過表達。

（a-c）通過芯片篩選，比較乳腺癌細胞與非癌乳腺細胞中circRNA的表達水平，發現了circ-Dnmt1在所有乳腺癌細胞中均有高表達。d. circ-Dnmt1在基因組的位置及過表達載體的構建構建。e. 驗證了相關引物的特異性。f. Northern實驗證明了circ-Dnmt1在細胞內的內源表達。g. circ-Dnmt1對MCF-7細胞增殖的影響。

2. circ-Dnmt1促進細胞自噬

圖2. MCF-7細胞中過表達circ-Dnmt1可促進細胞增殖。

（ab）. 過表達circ-Dnmt1后細胞衰老的比例明顯下降（β-gal染色陽性率低），LC3B明顯增多。c. 幾種自噬抑制劑處理后circ-Dnmt1表達會增加，這些抑制劑包括：SP600125、Chloroquine、LY294002、Wartmannin。d. 這些抑制劑的處理可阻止過表達circ-Dnmt1導致的細胞增殖和衰老相關的表型。（e-g）過表達circ-Dnmt1后，母基因Dnmt1的mRNA水平增加，但該基因轉錄初產物pre-mRNA（基于內含子序列的引物）并沒有增加，說明不是通過促進該基因的轉錄水平的作用。（hi）干擾circ-Dnmt1后Dnmt1和LC3B的表達降低，增加了細胞衰老。

3 circ-Dnmt1促進p53和AUF1入核

圖3. circ-Dnmt1促進p53和AUF1入核。

a. circ-Dnmt1轉染細胞能夠提高Dnmt1和LC3B的表達。b. circ-Dnmt1轉染細胞后，能夠提高circ-Dnmt1在胞核和胞質中的表達水平。c. circ-Dnmt1轉染細胞后，降低p53的表達和提高腫瘤形成。d. circ-Dnmt1轉染細胞后，能夠降低胞質中的p53的表達，提高胞核中p53的表達。不影響Auf1的總體表達，但是降低胞質中的Auf1的表達，提高胞核中Auf1的表達。e. 沉默circ-Dnmt1后能夠降低p53和Auf1的核轉錄。

4 細胞自噬能夠提高circ-Dnmt1、p53和AUF1入核

圖4. 細胞自噬與circ-Dnmt1表達水平和核定位有關。

（a-h）EBSS 和Rapamycin誘導的細胞自噬條件下，p53和AUF1也會入核，但干擾circ-Dnmt1后，這一入核現象消失。這些自噬誘導劑還可以促進Dnmt1和LC3B蛋白水平的增加。i. 過表達circ-Dnmt1后，circ-Dnmt1的核定位也增加。

5 circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用　　

圖5. circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用。

基于抗p53和AUF1的抗體RIP實驗證明，確實存在circ-Dnmt1于兩種蛋白的相互作用。計算機模擬實驗也佐證了這一相互作用現象。

6 計算機模擬證明circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用　

圖6 circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用位點驗證。

基于計算機模擬的結果，作者設計了突變載體和反義核苷酸片段，驗證是否可阻斷circ-Dnmt1與p53和AUF1的相互作用。突變和反義核苷酸均明顯抵消了過表達circ-Dnmt1后細胞的影響，包括增殖能力和衰老表型等。p53和AUF1的核定位也受到了影響，說明所預測的位點的確是circ-Dnmt1與p53和AUF1相互作用的位點。

至此，circ-Dnmt1在乳腺癌細胞中的作用機制已成型：高表達的circ-Dnmt1分子通過與p53和AUF1相互作用，最終三種分子均發生入核轉移，入核后的p53促進細胞自噬相關的基因表達，入核后的AUF1蛋白不再具有抑制Dnmt1 mRNA的功能，因此促進了Dnmt1蛋白的翻譯積累，抑制了p53的轉錄并促進了腫瘤增殖有關的基因表達。

7 過表達circ-Dnmt1促進腫瘤生長速度

圖7體內分析circ-Dnmt1的功能。

皮下腫瘤模型表明過表達circ-Dnmt1后腫瘤的生長速度明顯增加。自噬誘導劑也可以有類似的作用，而自噬抑制劑則阻止過表達circ-Dnmt1對腫瘤生長的影響。