惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)人單核細(xì)胞分化為M2巨噬細(xì)胞以及調(diào)控PD-L1的表達

外泌體由含有嵌入蛋白和RNA的膽質(zhì)層構(gòu)成，其三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。它可以保護生物活性，增強生物分布，并支持與局部或遠(yuǎn)處組織中的靶細(xì)胞的相互作用。
     外泌體可以介導(dǎo)惡性腫瘤之間動態(tài)交流，即使存在血腦屏障的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中的游離型外泌體也有這種作用。
     近日，來自美國德州大學(xué)MD安德森癌癥中心的Heimberger團隊在《Oncoimmunology》(IF=7.719)發(fā)表的《Glioblastoma stem cell-derived exosomes induce M2 macrophages and PD-L1 expression on human monocytes》一文中探討了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）來源干細(xì)胞（GSCs）分泌的外泌體（GDEs）是否可誘導(dǎo)免疫抑制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDEs傾向于被巨噬細(xì)胞前體——單核細(xì)胞攝取。GDEs進入單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組，并使單核細(xì)胞朝向免疫抑制性M2表型（包括程序性死亡配體1（PD-L1）表達）極化。質(zhì)譜分析表明，GDEs含有多種組分，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）途徑的成員，其功能介導(dǎo)該免疫抑制轉(zhuǎn)換。 Western blot分析顯示GSC外泌體處理的單核細(xì)胞和GBM患者浸潤的CD14 +細(xì)胞中的PD-L1的上調(diào)主要與STAT3的磷酸化增加相關(guān)，并且在一些情況下與p70S6激酶和Erk1 / 2的磷酸化相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明GDEs分泌的GBM釋放因子，是GBM相關(guān)免疫抑制性微環(huán)境的強效調(diào)節(jié)劑。

技術(shù)路線

實驗結(jié)果

1．免疫細(xì)胞群體對外泌體的攝取是可變的

圖1.外泌體的特征鑒定。（A）成纖維細(xì)胞MRC5、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞GSC20和GSC267細(xì)胞外泌體的代表性直方圖。（B）GSC20外泌體的透射電子顯微鏡圖像。（C）和（D）流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合到免疫磁珠的GSC20和MRC5外泌體。

圖2.免疫群體對外泌體的攝取是可變的。（A）GBM患者PBMCs與PKH67標(biāo)記的GSC外泌體(GSC-Exo)共培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測各種免疫細(xì)胞群對GSC-Exo的攝取情況；（B）GBM患者（左）和健康獻血者（右）的免疫細(xì)胞群體攝取PKH-67標(biāo)記的GSC20-Exo的數(shù)據(jù)。（C）用抗CD3/CD28抗體激活T細(xì)胞，用PMA和離子霉素激活NK細(xì)胞，然后將細(xì)胞與PHK67標(biāo)記的GSC20外泌體孵育6小時。流式細(xì)胞儀檢測被CD4+或CD8+T細(xì)胞及CD56+NK細(xì)胞攝取的外泌體。

2.GSC-Exo定位于單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞其肌動蛋白重組

圖3.人單核細(xì)胞外泌體內(nèi)化過程。（A）單核細(xì)胞攝取外泌體的動力學(xué)研究。（B）（C）PKH67標(biāo)記的外泌體被單核細(xì)胞攝取的共聚焦顯微鏡圖像。（D）用共聚焦顯微鏡觀察單核細(xì)胞與PKH67標(biāo)記的外泌體共培養(yǎng)48小時后Phalloidin標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)情況。白色箭頭指示肌動蛋白重組（E）外泌體孵育的單核細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)。

3.GSC-Exo誘導(dǎo)單核細(xì)胞極化為M2巨噬細(xì)胞表型

圖4.GSC-Exo將單核細(xì)胞極化為M2樣表型。（A）用不同來源外泌體孵育的單核細(xì)胞中M1和M2標(biāo)記蛋白的表達情況（左）及PD-L1（右）的平均熒光強度[MFI ]。（B）GBM患者組織中的單核細(xì)胞標(biāo)志物IbA1（綠色）和PD-L1抗體（紅色）染色圖像。（C）外泌體孵育單核細(xì)胞后MCP-3和CXCL1的相對像素密度。

4.GSC-Exo含有EIF2、mTOR和EphrinB信號通路蛋白

圖5 GSC-Exo和成纖維細(xì)胞外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。（A）GSC來源（GSC20、GSC17、GSE267）的外泌體與成纖維細(xì)胞（MRC5，WI38）外泌體差異蛋白的通路注釋。（B）成纖維細(xì)胞（MRC5，WI38）外泌體和GSC外泌體差異蛋白火山圖。

圖6 GSC外泌體和成纖維細(xì)胞外泌體蛋白的亞細(xì)胞定位和功能分析。（A）成纖維細(xì)胞源性外泌體的蛋白質(zhì)和GSC外泌體蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；（B）成纖維細(xì)胞源性外泌體的蛋白質(zhì)和GSC外泌體蛋白質(zhì)的功能。

5. GSC外泌體誘導(dǎo)人單核細(xì)胞PD-L1上調(diào)，與STAT3磷酸化有關(guān)

圖7外泌體孵育的人單核細(xì)胞PD-L1通路分析及GBM患者血液和腫瘤組織分離的CD14+細(xì)胞的PD-L1通路分析（A）p- STAT3、P- STAT1、P- Akt、β-actin、HSP70在成纖維細(xì)胞、GSCs、成纖維細(xì)胞和GSC衍生的外泌體表達分析。（B）用成纖維細(xì)胞和GSC衍生的外泌體處理兩個供體的單核細(xì)胞中PD-L1、P- STAT3、STAT3、GAPDH的表達分析。（C）經(jīng)外泌體孵育的人單核細(xì)胞中PD-L1和P- STAT3蛋白表達的密度分析。（D）PD-L1、p- STAT3、p- STAT1、p-ERK1／2、pJNK、pp70S6K和GADPH在健康對照外周血CD14+細(xì)胞、GBM患者的CD14+細(xì)胞和GBM浸潤的CD14+細(xì)胞的Western分析。