PNAS: 癌癥外泌體hsa-miR-940通過靶向ARHGAP1和FAM134A促進腫瘤微環境中的成骨表型

癌的骨轉移性病變被歸類為成骨性或溶骨性病變。前列腺癌和乳腺癌患者通常分別表現出成骨型和溶骨型骨轉移。在轉移灶中，腫瘤細胞與許多不同的細胞類型相互作用，包括成骨細胞、破骨細胞和間充質干細胞，導致成骨性或溶骨性表型。然而，負責骨重建的機制尚未完全闡明。近期美國國家科學院院刊PNAS上發表了名為《Cancer-secreted hsa-miR-940 induces an osteoblastic phenotype in the bone metastatic microenvironment via targeting ARHGAP1 and FAM134A》（IF: 9.661）的文章，東京醫科和牙科大學（TMDU）的研究人員報告了一種miRNA分子，該分子可能在前列腺癌引起的骨重建中起關鍵作用。

在該項研究中，研究人員對多種人類癌細胞系分泌的外泌體miRNA進行了全面的表達分析，并篩選出八種在成骨細胞表型誘導的前列腺癌細胞系分泌的外泌體中高表達的miRNA。其中，hsa-miR-940通過靶向結合ARHGAP1和FAM134A顯著促進人間充質干細胞的成骨分化。有趣的是，盡管MDA-MB-231乳腺癌細胞通常被稱為誘導溶骨性表型的癌細胞系，但是植入過表達miR-940的MDA-MB-231細胞同樣可以通過促進宿主間充質細胞的成骨分化，在由此產生的腫瘤中誘導廣泛的成骨細胞生成性病變。作者的研究結果表明骨轉移的表型可以在骨微環境中由癌細胞分泌的miRNA誘導。

技術路線

實驗結果

1. 鑒定由成骨細胞表型誘導癌細胞系顯著分泌的外泌體miRNA

Figure 1

圖1 A) C4-2B為誘導成骨性表型的癌細胞系，MDA-MB-231為誘導溶骨性表型的癌細胞系，在NOX / SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷）小鼠脛骨內注射腫瘤細胞后的X射線圖像和脛骨H&E染色。在溶骨性病變中觀察到幾個破骨細胞（箭頭）。

B) 前列腺癌細胞系分泌的外泌體miRNA芯片分析表明，與溶骨性表型誘導的癌細胞系分泌的外泌體相比，八種人的miRNA在成骨細胞表型誘導的癌細胞系分泌的外泌體中高度表達（使用來自非癌細胞的外泌體HEK293作為標準化對照，紅色表示較高的表達，而藍色表示相對于對照較低的表達）。

2. hsa-miR-940促進人間充質干細胞（hMSC）的成骨分化

Figure 2

圖2 A) 構建一種含有CD63（外泌體標記物）的逆轉錄病毒載體，與改良的黃色熒光蛋白（Venus）融合,然后用逆轉錄病毒感染系統建立CD63-Venus穩定表達癌癥細胞系（C4-2B-CD63-Venus）。通過超速離心從細胞上清液中分離Venus標記的外泌體，并將其加入表達tdTomato的永生化hMSC中（左圖）；共聚焦顯微鏡圖像顯示Venus標記的C4-2B外泌體摻入hMSC（中間圖）；qPCR分析顯示用C4-2B外泌體培養的hMSC中ALPL表達增強（右圖）。

B) 經過14-d的骨化誘導后，hMSC堿性磷酸酶（ALP）分析表明，miR-940或miR-1260a過表達使ALP活性增加，明顯促進了hMSCs的成骨分化。

C)在28-d誘導之后，對hMSC進行von Kossa染色，發現miR-940過表達引起了廣泛的礦化結節（成骨細胞分化成熟的標志）。

D) qPCR分析顯示7-d成骨誘導后，miR-940過表達的hMSC與空載體感染的hMSC相比BGLAP基因的mRNA表達沒有明顯差異，ALPL的mRNA表達增強。

3. ARHGAP1和FAM134A是hsa-miR-940促進成骨分化的靶標

Figure 3

圖3 A)用四個靶標預測數據庫Target Scan，miRDB，miRanda和miRWalk進行miRNA靶基因預測分析,19個在四個數據庫中重疊的候選基因鑒定為miR-940的靶標。

B) 用各候選基因的siRNA轉染hMSC并在成骨誘導培養基中培養，經14天成骨誘導后，ARHGAP1和FAM134A的下調顯著增強hMSC的ALP活性。

C) 穩定過表達ARHGAP1或FAM134A的hMSCs中ALP活性顯著降低。

D) E) hMSC中miR-940過表達降低了ARHGAP1和FAM134A蛋白水平以及它們的mRNA表達水平。

4. 癌癥分泌的hsa-miR-940通過外泌體轉移至間充質干細胞并促進成骨

Figure 4

圖4 A) 用慢病毒感染系統建立hsa-miR-940過表達MDA-MB-231細胞（上圖）；以空載體感染的MDA-MB-231細胞為對照，用pri-mir-940的基因組片段轉導MDA-MB-231細胞，與對照細胞相比，過表達細胞顯示miR-940以及pri-mir-940的表達增強（左圖）；將來自過表達miR-940的MDA-MB-231細胞（Exo-miR-940）的外泌體或來自空載體感染細胞的外泌體（Exo-對照）加入到hMSC的培養基中，qPCR分析顯示摻入Exo-miR-940的hMSC比Exo對照組miR-940表達更強，而pri-mir-940的表達水平沒有改變（右圖）。

B) qPCR分析顯示在用Exo-miR-940培養的hMSC中ALPL的表達顯著上調。

C)蛋白質印跡分析顯示ARHGAP1和FAM134A的蛋白質水平在Exo-miR-940培養的hMSC中下調。

5. 癌癥分泌的hsa-miR-940在體內的骨骼微環境中誘發成骨細胞損傷

Figure 5

圖5 A) 建立miR-940過表達的MDA-MB-231-CD63-Venus細胞，miR-940-H1和miR-940- H2表現出不同水平的miR-940過表達。

B) 將過表達miR-940的腫瘤細胞植入裸鼠的顱骨。

C) 過表達miR-940的MDA-MB-231細胞在內部形成具有廣泛礦化組織的腫瘤。

D) H&E和von Kossa染色證實礦化組織由骨基質組成，并被成骨細胞樣細胞或類骨質包圍。

E) 用流式細胞術分離發育的腫瘤并分離GFP⁺ 宿主細胞，從分選的細胞中提取蛋白質并進行蛋白質印跡分析。結果顯示，在摻入癌細胞衍生的外泌體的GFP⁺ 宿主細胞中，miR-940靶基因ARHGAP1和FAM134A的蛋白質水平被抑制。

F) 用三個樣品進行qPCR分析，結果顯示其中兩個樣品與人非致瘤性前列腺上皮細胞（RWPE-1細胞）或骨組織相比具有更高的miR-940表達。

結論

前列腺癌分泌的hsa-miR-940在體外促進了hMSCs的成骨分化，并在體內骨轉移性微環境中誘導了廣泛的成骨細胞損傷。該研究提供了癌癥分泌的miRNA誘導成骨細胞型骨轉移的證據，在骨骼微環境中作為向骨性因子。