HoxC5和miR-615-3p協(xié)同抑制hTERT的表達(dá)，從而抑制腫瘤發(fā)生
在細(xì)胞分化過(guò)程中，端粒酶活性的抑制促進(jìn)復(fù)制性衰老，同時(shí)作為包括人類(lèi)在內(nèi)的長(zhǎng)壽性哺乳類(lèi)生物腫瘤發(fā)生的生理障礙物。然而這其中的內(nèi)部機(jī)制依舊不清楚。因此有研究人員對(duì)此進(jìn)行了研究，并以“HoxC5 and miR-615-3p target newly evolved genomic regions to repress hTERT and inhibit tumorigenesis”為題，發(fā)表在Nature Communications（IF=12.124）上。作者研究了miR-615-3p是如何抑制hTERT的表達(dá)。miR-615-3p位于基因HOXC5的內(nèi)含子區(qū)域。HOXC5屬于高度保守的控制胚胎發(fā)生和發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子同源異型細(xì)胞框家族。出乎意料地是HOXC5通過(guò)阻斷hTERT啟動(dòng)子和其末端增強(qiáng)子之間的相互作用抑制hTERT的表達(dá)。在長(zhǎng)壽的靈長(zhǎng)類(lèi)生物中，hTERT的3’UTR區(qū)域和其上游的增強(qiáng)子區(qū)域是非常保守的。細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-615-3p和hTERT被激活，并構(gòu)成前饋環(huán)路協(xié)調(diào)hTERT的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后抑制。miR-615-3p和hTERT的表達(dá)異?？赡苡兄诎┌Y發(fā)生過(guò)程中hTERT的激活。
研究路線：
 
研究結(jié)果：
 
圖1  假定的miRNAs靶向hTERT 3’UTR區(qū)域的鑒定。a. RT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系中hTERT mRNA的表達(dá)量。人的胚胎干細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)量設(shè)為1。b. TRAP鑒定不同細(xì)胞系中端粒酶活性。c-e.與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染psiCHECK2空載體的細(xì)胞相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染psiCHECK2-5’UTR、psiCHECK2-3’UTR或psiCHECK2-5’+3’UTR載體的細(xì)胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度。f. 在穩(wěn)定表達(dá)psiCHECK2-5’+3’UTR載體的海拉細(xì)胞中使用miRNA抑制劑文庫(kù)，log₂ ^{Renilla/Firefly熒光素酶熒光強(qiáng)度比率}的Z值分布圖。Z值>2.7的選作候選基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。g-i. 分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染8個(gè)候選miRNA抑制劑的海拉細(xì)胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度、hTERT mRNA表達(dá)量和端粒酶活性。在干細(xì)胞和終端分化細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA標(biāo)記為紅色。
 
 
圖2  在癌癥細(xì)胞中miR-615-3p反向調(diào)節(jié)hTERT的表達(dá)。a.不同物種中miR-615-3p和TERT 3’UTR預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)示意圖。b.在psiCHECK2-5’+3’UTR報(bào)告載體中miR-615-3p結(jié)合位點(diǎn)引入突變的示意圖。c.在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型或突變體psiCHECK2-5’+3’UTR報(bào)告載體的Hela和RKO細(xì)胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度。d、e.在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)照發(fā)夾結(jié)構(gòu)或miR-615-3p抑制劑的RKOHOP-92和RXF393細(xì)胞中，hTERT mRNA表達(dá)量和端粒酶活性。f、g.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體或miR-615-3p的過(guò)表達(dá)載體的RPMI-8226、IGR-OV1和HCC-2998細(xì)胞中，hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量和端粒酶活性。h.在2個(gè)獨(dú)立的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的miR-615-3p敲除的RKO細(xì)胞系中內(nèi)源miR-615-3p的表達(dá)量。i-k.在miR-615-3p敲除的RKO細(xì)胞系中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量、端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度。
 
 
圖3  HOXC5抑制hTERT的表達(dá)。a.miR-615-3p基因定位于HOXC5內(nèi)含子區(qū)域的示意圖。b、c.載有flag標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549細(xì)胞中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量和端粒酶活性。d. 載有flag標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549細(xì)胞中端粒酶長(zhǎng)度。e.表達(dá)對(duì)照發(fā)夾結(jié)構(gòu)或兩個(gè)獨(dú)立的干擾HOXC5的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Hela細(xì)胞中內(nèi)源hTERT mRNA的表達(dá)量。f. 表達(dá)對(duì)照發(fā)夾結(jié)構(gòu)或兩個(gè)獨(dú)立的干擾HOXC5的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Hela細(xì)胞中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量。g. 表達(dá)對(duì)照發(fā)夾結(jié)構(gòu)或兩個(gè)獨(dú)立的干擾HOXC5的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Hela細(xì)胞中端粒酶長(zhǎng)度。
 
 
圖4  人胚胎干細(xì)胞WA01中hTERT、miR-615-3p、HOXC5、PBX1-4和MEIS1-3的表達(dá)量。a. 人胚胎干細(xì)胞在單層培養(yǎng)中的神經(jīng)分化過(guò)程。b.RT-PCR檢測(cè)胚胎干細(xì)胞WA01神經(jīng)分化過(guò)程中，多潛能基因（NANOG和OCT-4）和神經(jīng)發(fā)育基因PAX6的表達(dá)量。胚胎干細(xì)胞WA01神經(jīng)分化過(guò)程中，hTERT mRNA（c）、miR-615-3p（d）和HOXC5 mRNA（e）的表達(dá)量。f. WA01神經(jīng)分化P0和P3階段，PBX1-4和MEIS1-3的表達(dá)量。
 
 
圖5  在Hela細(xì)胞中，HOXC5招募Pbx4和Meis3，抑制hTERT的表達(dá)。a.HOXC5功能區(qū)示意圖。b、c. 載有flag標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)GFP、WT或突變體（M1或M2）HOXC5的Hela細(xì)胞中hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量和端粒酶長(zhǎng)度。d. Western blotting顯示了Hela細(xì)胞中GFP、WT和突變體（M1或M2）HOXC5的表達(dá)量。e.在Hela細(xì)胞中，V5標(biāo)簽的HOXC5導(dǎo)致特異地Flag標(biāo)簽的Pbx4的免疫共沉淀反應(yīng)；但對(duì)Flag標(biāo)簽的Pbx1、Pbx2或Pbx3沒(méi)有影響。f. 在Hela細(xì)胞中，6xHis標(biāo)簽的HOXC5蛋白與體外翻譯的、³⁵S-蛋氨酸標(biāo)記的Pbx4蛋白互作；但是對(duì)Pbx1、Pbx2或Pbx3沒(méi)有反應(yīng)。g. 在Hela細(xì)胞中，F(xiàn)lag標(biāo)簽的HOXC5導(dǎo)致V5標(biāo)簽的Meis3的免疫共沉淀反應(yīng)；但對(duì)V5標(biāo)簽的Meis1或Meis3沒(méi)有影響。h. 在Hela細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染共表達(dá)PBX4或MEIS3和HOXC5的質(zhì)粒協(xié)同抑制hTERT mRNA的表達(dá)。
 
 
圖6  HOXC5通過(guò)結(jié)合到hTERT上游增強(qiáng)子區(qū)域抑制hTERT的表達(dá)。a.ChIP-Seq顯示HOXC5和PBX4在hTERT TSS上游-20kb區(qū)域結(jié)合；hTERT TSS區(qū)域富集有H3K27ac和H3K4me1，尤其是在端粒酶陽(yáng)性的胚胎干細(xì)胞（WA01）癌癥細(xì)胞（PC-3）中，但是在端粒酶陰性的初級(jí)纖維細(xì)胞（IMR90）中卻沒(méi)有。b. 過(guò)表達(dá)對(duì)照GFP或Flag標(biāo)簽的HOXC5的PC-3細(xì)胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結(jié)果。c.過(guò)表達(dá)對(duì)照GFP或Flag標(biāo)簽的HOXC5的A375細(xì)胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結(jié)果。d.WA01細(xì)胞中神經(jīng)分化（P4）前后RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結(jié)果。e.在A375細(xì)胞中共表達(dá)dCas9-KRAB和對(duì)照sgRNAs或sgRNAs靶向HOXC5在hTERT增強(qiáng)子上游-20kb結(jié)合區(qū)域的內(nèi)源hTERT mRNA的表達(dá)量。f.在PC-3細(xì)胞中，與內(nèi)源HOXC5結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的前10條生物學(xué)過(guò)程。
 
 
圖7  HOXC5抑制hTERT的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在PC-3細(xì)胞中表達(dá)GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同時(shí)表達(dá)miR-615-3p和HOXC5的體外克隆形成實(shí)驗(yàn)中的典型圖像（a）和表達(dá)量（b）。腫瘤生長(zhǎng)曲線（c）、腫瘤生長(zhǎng)代表圖像（d）和腫瘤重量（e）展示了NSG小鼠注射表達(dá)GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同時(shí)表達(dá)miR-615-3p和HOXC5的PC-3細(xì)胞后腫瘤生長(zhǎng)情況。散點(diǎn)圖展示了THYM（胸腺瘤，上圖）和TGCT（睪丸狀干細(xì)胞瘤，下圖）癌癥樣本中hTERT和HOXC5之間的斯皮爾曼相關(guān)性（f、i），miR-615-3p和hTERT之間的相關(guān)性（g、j）以及HOXC5和miR-615-3p之間的相關(guān)性（h、k）。

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