肺癌是全球最常見的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是最常見的肺癌亞型。早期LUAD可通過根治性切除治愈，但晚期LUAD目前尚無根治性治療方法，盡管近年來分子靶向治療、免疫治療和聯合治療取得了進展。這與疾病轉移到原發部位以外密切相關。然而，參與肺腺癌轉移的分子機制尚不完全清楚，雖然已知上皮-間充質轉化（EMT）在驅動轉移過程中至關重要，而波形蛋白作為一種中間絲蛋白，在EMT過程中發揮著減少細胞間黏附和重組細胞結構的關鍵作用，使細胞變得更具有遷移和侵襲性。目前幾乎所有的癌癥生物標志物和治療方法都以蛋白質和編碼這些蛋白質的基因為靶點。然而，越來越多的人認識到非編碼RNA在多種病理生物學過程中發揮著重要作用。特別是lncRNA的失調與癌癥的發病機制密切相關。lncRNA常與其他生物分子建立分子間相互作用。這使得lncRNA可以作為拴系、導向、誘餌或支架來承擔各種生物學功能，包括癌癥的發生、發展和治療抵抗。值得注意的是，參與肺腺癌發病機制的失調lncRNA列表也在迅速擴展。然而，lncRNA在肺腺癌轉移中的作用仍有待完全闡明。該研究發表在《Biomarker Research》，IF：11.1。

技術路線：

主要研究結果：

1、LINC01559高表達與肺腺癌轉移及患者不良預后相關

         為了更好地了解lncRNA在肺腺癌轉移中的作用，作者研究了先前發表的基因表達芯片數據集treatment-na?ve非小細胞肺癌（NSCLC），該數據集包含不同病理分期的肺腺癌病例。該分析顯示，與無轉移病灶的肺腺癌患者相比，5個注釋的lncRNA（HAND2-AS1、GLIS3-AS1、MRVI1-AS1、LINC00612和LINC01559）在有轉移病灶的肺腺癌患者的支氣管鏡活檢組織中表達水平較高（圖1A）。有趣的是，癌癥基因組圖譜（TCGA）中LUAD數據集的分析顯示，LINC01559的高表達與LUAD患者的總生存（OS）相關（圖1B），而其他lncRNA的高表達與LUAD患者的OS無關（圖1B）。事實上，在TCGA LUAD數據集中，與配對的非癌肺組織相比，LINC01559在LUAD中表達水平升高（圖1C）。

         通過原位雜交分析，作者證實了LINC01559在90例福爾馬林固定石蠟包埋的肺腺癌樣本中表達上調（圖1D，E）。根據患者性別和診斷時的中位年齡分層的不同組的肺腺癌中，LINC01559的表達沒有顯著差異。LINC01559高表達與肺腺癌較高的組織學分級（III-IV級）和晚期（美國癌癥聯合委員會 III-IV期）相關。進一步分析顯示，LINC01559高表達與患者較差的OS相關（圖1F）。此外，多變量Cox回歸分析顯示，LINC01559的高表達與OS獨立于分期和診斷時的年齡（肺腺癌患者的明確預后標志物）相關。同樣，LINC01559在4個肺腺癌細胞系中的3個中的表達水平高于人成纖維細胞系HSF（圖1G）。綜上所示，LINC01559在肺腺癌中表達上調，尤其是在伴有轉移的肺腺癌中，其高表達與肺腺癌患者的不良預后相關。因此，作者著重研究LINC01559在肺腺癌轉移中的潛在作用及其相關的分子機制。

圖1 LINC01559在有轉移的肺腺癌中高表達，與患者不良預后相關

2、LINC01559促進肺腺癌轉移

         為了功能性地檢測LINC01559在肺腺癌轉移中的作用，作者使用兩個獨立的siRNA在A549和H1299細胞中敲低LINC01559（圖2A）。事實上，在劃痕實驗中，siRNA敲低顯著延遲了LUAD細胞的傷口愈合，在transwell實驗中降低了它們對Matrigel基質膠的遷移和侵襲（圖2B-E）。

         為了進一步研究，作者建立了A549亞系A549。shRNA穩定敲低LINC01559的shLINC01559（圖2F）。此外，NOD/SCID小鼠尾靜脈注射A549。與注射攜帶對照shRNA的A549的細胞相比，shLINC01559細胞的肺轉移病灶形成顯著減少（圖2G，H）。對隨機選取的肺結節進行蘇木精-伊紅（H&E）染色，病理證實肺轉移（圖2I）。綜上所述，這些結果表明LINC01559促進肺腺癌的體內轉移。

圖2 LINC01559促進肺腺癌轉移

3、LINC01559與波形蛋白相互作用

         為了了解LINC01559促進肺腺癌轉移的機制，作者使用qPCR分析A549和H1299細胞的亞細胞部分來檢測其亞細胞定位。該分析表明LINC01559主要定位于LUAD細胞的細胞質（圖3A）。值得注意的是，當作者使用RNA pulldown（RPD）和質譜分析與LINC01559相互作用的蛋白時，發現與LINC01559共沉淀的蛋白中含量最多的是波形蛋白（圖3B），這是一種主要位于細胞質的中間絲蛋白，與細胞的運動、侵襲和轉移密切相關。作者隨后在A549和H1299細胞中使用RPD和RNA免疫沉淀實驗證實了LINC01559和波形蛋白的關聯（圖3C，D）。總之，這些結果表明，LINC01559和波形蛋白之間的相互作用可能在LINC01559介導的促肺腺癌細胞轉移中發揮作用。

圖3 LINC01559與波形蛋白結合

4、波形蛋白在LINC01559介導的肺腺癌細胞遷移和侵襲中發揮重要作用

         作者接下來研究了波形蛋白在LINC01559介導的肺腺癌細胞遷移和侵襲中的功能重要性。transwell實驗顯示，siRNA敲低波形蛋白降低了A549和H1299細胞的侵襲和遷移（圖4A-C）。重要的是，進一步的分析表明，波形蛋白過表達阻止了siRNA敲低LINC01559引起的遷移和侵襲的減少，而敲低波形蛋白抑制了LINC01559過表達引起的遷移和侵襲的促進（圖4D-F）。因此，波形蛋白是LINC01559促進肺腺癌細胞遷移和侵襲所必需的。

圖4 波形蛋白在LINC01559介導的肺腺癌細胞遷移和侵襲中發揮重要作用

5、LINC01559促進波形蛋白表達

         為了進一步了解LINC01559與波形蛋白相互作用的意義，作者檢測了敲低和未敲低LINC01559的A549和H1299細胞中波形蛋白的表達。有趣的是，雖然siRNA敲低LINC01559并沒有引起波形蛋白 mRNA水平的任何顯著變化（圖5A），但它顯著降低了A549和H1299細胞中波形蛋白蛋白的表達（圖5B）。相比之下，過表達LINC01559導致波形蛋白蛋白水平的上調（圖5C），而波形蛋白 mRNA的表達沒有明顯變化（圖5D）。另一方面，在A549和H1299細胞中，波形蛋白的敲低和過表達都沒有觸發LINC01559的表達變化（圖5E，F）。因此，LINC01559通過轉錄后增加促進波形蛋白的表達。從A549分離的LUAD細胞具有指導意義。與攜帶對照shRNA的A549細胞相比，shLINC01559肺轉移瘤細胞的波形蛋白表達水平同樣較低（圖5G），表明LINC01559在體內調節LUAD細胞的波形蛋白表達。

圖5 LINC01559促進波形蛋白表達

6、LINC01559通過抑制波形蛋白的泛素化而穩定波形蛋白

         在發現LINC01559通過轉錄后上調促進波形蛋白表達后，作者在敲低或未敲低LINC01559的A549和H1299細胞中進行了放線菌酮追逐實驗。事實上，siRNA敲低LINC01559加速了波形蛋白的轉換（圖6A），表明LINC01559調節了波形蛋白的穩定性。與此同時，蛋白酶體抑制劑MG132的處理減少了siRNA敲低LINC01559引起的波形蛋白的減少（圖6B）。由于多聚泛素化是蛋白酶體介導的蛋白降解所必需的，作者測試了LINC01559是否影響波形蛋白的多聚泛素化。事實上，siRNA敲低LINC01559導致A549和H1299細胞中波形蛋白多泛素化增加（圖6C）。相比之下，過表達LINC01559導致細胞中波形蛋白的多泛素化降低（圖6D）。重要的是，A549來源的LUAD細胞中波形蛋白的多泛素化更強。與來自A549.sh-ctrl肺轉移瘤的腫瘤進行比較（圖6E）。綜上所述，這些結果表明LINC01559通過抑制波形蛋白的多泛素化來促進LUAD細胞中波形蛋白的表達。

圖6 LINC01559穩定波形蛋白

結論：

         lncRNA LINC01559與波形蛋白結合并阻止其泛素化和蛋白酶體降解，從而促進肺腺癌細胞遷移、侵襲和轉移。LINC01559在轉移性肺腺癌中表達上調，LINC01559高表達與肺腺癌患者的不良預后相關。這些結果揭示了一個新的lncRNA介導的促進肺腺癌進展的機制，并提示LINC01559的表達可能是肺腺癌患者的獨立預后因素，靶向LINC01559可能是治療晚期肺腺癌的潛在方法。

實驗方法

         細胞培養，實時熒光定量PCR(qPCR)，傷口愈合試驗，Transwell遷移和侵襲實驗，原位雜交(ISH)，RNA pull-down，RNA免疫沉淀(RIP)，質譜分析，泛素化分析，小鼠肺腺癌轉移模型

參考文獻：

         Feng H, Xu D, Jiang C, Chen Y, Wang J, Ren Z, Li X, Zhang XD, Cang S. LINC01559 promotes lung adenocarcinoma metastasis by disrupting the ubiquitination of vimentin. Biomark Res. 2024 Feb 5;12(1):19. doi: 10.1186/s40364-024-00571-3. PMID: 38311781; PMCID: PMC10840222.