線粒體ND5 mRNA有一個m1A位點。ND5是呼吸鏈復合體I的一個亞基。它被認為是氧化和質子傳輸耦合的關鍵。在這里，作者證明了這個m1A位點可能參與阿爾茨海默病（AD）的病理生理學。這種神經退行性疾病的病理特征之一是線粒體功能障礙，主要由淀粉樣β（Aβ）引起。Aβ主要干擾呼吸鏈復合體I和IV的功能。然而，復合物I功能障礙的分子機制仍不完全清楚。作者在AD細胞模型和AD患者中發現ND5 mRNA的m1A甲基化增強。這種m1A甲基化的形成是由TRMT10C蛋白水平的增加催化的，導致ND5翻譯抑制。因此，本文首次證明，TRMT10C誘導的ND5 mRNA的m1A甲基化導致線粒體功能障礙。該研究結果表明，這一新發現的機制可能與Aβ誘導的線粒體功能障礙有關。該研究于2024年1月發表在《molecular psychiatry》，IF 11。

技術路線：

主要研究結果：

1 AD細胞模型和AD患者TRMT10C mRNA和蛋白表達增強

TRMT10C定位在線粒體ND5 mRNA上安裝m1A。這種mRNA甲基化易于抑制ND5蛋白翻譯，ND5蛋白是呼吸鏈復合體I的一個亞基（圖1A）。到目前為止，尚不清楚這種機制是否會損害線粒體的整體功能，如線粒體呼吸和膜電位，以及是否與AD等神經退行性疾病的病理變化有關。為研TRMT10C在AD中的作用，作者假設了以下實驗可驗證的假設。（i）TRMT10C蛋白水平在AD細胞模型和AD患者中發生改變，（ii）因此，ND5 mRNA的m1A甲基化增加，導致（iii）ND5蛋白表達減少。通過這一因果鏈，ND5 mRNA的m1A甲基化增強導致（iv）線粒體功能受到影響（圖1A）。

為闡明第一個假設，作者使用了AD細胞模型、AD患者死后組織和公開可用的RNA-Seq數據庫。研究了穩定過表達野生型人類淀粉樣前體蛋白（APPwt）的HEK 293細胞中TRMT10C蛋白水平，該蛋白顯示aβ1-40水平增加了10倍。在該細胞模型中，與對照細胞相比，TRMT10C蛋白水平顯著增加（圖1B）。在從荷蘭腦庫（NBB）獲得的AD患者死后額葉皮層樣本中，作者檢測到與對照組相比TRMT10C蛋白水平顯著升高（圖1C）。作者只能接受13名AD患者死后組織和12名對照。此患者數量可能導致結果不足。

為進一步闡明TRMT10C在AD中的作用，作者使用了來自兩個人類數據庫的RNA-Seq數據。其中之一是衰老、癡呆和創傷性腦損傷（AgDemTBI）研究，分析了其中四個不同大腦區域的轉錄組。比較了所有未發生腦外傷和確診AD的患者的FPKM值。與對照組相比，AD患者的TRMT10C mRNA水平沒有改變（圖1D）。

使用單細胞轉錄組學分析（scRNA-Seq）檢測來自24名AD患者和24名年齡匹配的對照組額葉皮層的6種主要腦細胞類型，作者觀察到興奮性和抑制性神經元中TRMT10C mRNA水平增加。在星形膠質細胞、少突膠質細胞、前體少突膠質膠質細胞和小膠質細胞中未發現顯著變化（圖1E）。這種神經元特異性增加在AD的早期階段已經很顯著，并且在后期仍然存在。

圖1：TRMT10C蛋白和mRNA水平在AD細胞和動物模型中以及AD患者皮層中增加

2 Aβ介導的氧化應激增強TRMT10C蛋白表達

到目前為止，作者使用Aβ過表達HEK-APPwt細胞模型、NBB-AD死后組織和數據庫的數據表明，Aβ可能在TRMT10C過表達中發揮作用。然而，其他病理變化，如與氧化應激升高相關的線粒體功能障礙，也可能導致這些變化。為遵循這一想法，用低聚Aβ1-42（100 nM）或H2O2（250μM）處理HEK-Ctl細胞24小時，并分析TRMT10C蛋白的表達。在這兩種應激源下，作者觀察到TRMT10C蛋白表達升高（圖1F）。A?水平升高損害線粒體功能的一個眾所周知的機制是通過復合物I功能障礙產生的氧化應激增加。因此，作者使用維生素C（1000μM）清除活性氧化劑。這種處理導致HEK APPwt細胞中TRMT10C蛋白表達的挽救（圖1G）表明氧化應激在AD細胞模型中新描述的改變中起著至關重要的作用。

3 TRMT10C的酶伴侶亞基在AD中受到不同影響

TRMT10C需要輔因子SDR5C1在（mt）tRNA（13）的位置9上顯示甲基轉移酶活性；尚未研究ND5 A1374甲基化的情況是否也是如此（圖2A）。TRMT10C-SDR5C1復合物也是mtRNase P的重要組成部分，需要實際核酸亞基PRORP切割。鑒于對TRMT10C的研究，這引發了一個問題，即SDR5C1和PRORP的表達在AD中是否也發生了變化。

令人驚訝的是，HEK-APPwt細胞中PRORP蛋白水平顯著降低（圖2B）。在AD額葉皮層死后樣本中，未檢測到PRORP蛋白表達的顯著變化（圖2C）。同樣，在兩個RNA-Seq數據集中也沒有發現mRNA水平的差異（圖2D）。

接下來，作者將重點放在SDR5C1上，發現HEK APPwt細胞中的蛋白質水平顯著增強，但人類死后組織中的蛋白質含量沒有顯著增強（圖2E，F）。AgDemTBI研究數據庫顯示SDR5C1 mRNA表達沒有顯著變化（圖2G）。scRNA-Seq數據顯示，SDR5C1mRNA水平僅在興奮性和抑制性神經元中強烈上調（圖2H）。

圖2：WB和人類數據庫評估揭示線粒體RNase P亞基SDR5C1和PRORP的不同表現

4 AD細胞模型和患者的m1A水平升高

在表明m1A寫入酶TRMT10C在AD模型和人類AD皮層樣本中持續上調后，作者仔細研究了一個合理的含義，即ND5 mRNA中的m1A水平是否會如假設（ii）中所指出的那樣在AD病理中升高。作者首先使用基于逆轉錄和Illumina測序過程中m1A誘導的錯誤結合位點特異性分析方法分析了AD細胞模型。由于知道錯誤結合和逆轉錄阻滯的產生在很大程度上取決于反應條件和逆轉錄酶，作者使用了SuperScript IV（SS-IV），因為它在修飾位點上提供了高的通讀能力，從而產生更適合RT-PCR和錯配率分析的全長產物。作者發現，與對照相比，來自HEK APPwt細胞的總RNA樣本中ND5 mRNA 1374位的錯誤結合水平升高（圖3A），以及從線粒體提取物中分離的RNA。在這兩組中，錯配主要由T和G組成，這表明m1A在與SS-IV的RT過程中主要引起A和C的結合。此外，ND5 mRNA甲基化的增加反映在總RNA和線粒體RNA制劑中HEK-APPwt的跳躍率升高（圖3A）。跳躍是由于m1A破壞逆轉錄酶而發生的核苷酸跳躍事件，是評估m1A甲基化的第二個獨立參數。在NBB樣本中，在第一次分析之后，m1A失配率沒有改變。在作者根據Braak分期（衡量所有患者的神經病理學運動場）分離數據后，這幅景象發生了變化。當將 AD 與 Braak 階段 5 + 6 與對照組與 Braak 階段 0-3 進行比較時，發現錯配和跳躍率顯著增加（圖3C）。2例AD患者攜帶G13708A SNP，該SNP在歐亞J單倍群中普遍存在。該SNP被證明可以防止m1A下游兩個堿基的甲基化（ND5 mRNA中的1374位等于mtDNA的13710位）。在這些患者中，作者沒有發現任何不匹配。因此，這些人被排除在分析之外。

生物化學證據表明，TRMT10C和SDR5C1形成一個穩定的亞復合物，作為tRNA甲基轉移酶具有活性，并且能夠在（mt）tRNA的第9位將腺苷和鳥嘌呤核苷酸甲基化。22 mt tRNA中的19個在第9位含有A或G。因此，作者從HEK-Ctl和HEK-APPwt細胞中分離出線粒體tRNA，并定量了m1A和m1G水平。作者沒有觀察到顯著的變化，這表明mt tRNA已經被完全修飾，或者在與SDR5C1的復合物之外過量的TRM10C不靶向（mt）tRNA進行甲基化。

圖3：ND5 mRNA 中 1374 位的 m1A 水平在 AD 模型細胞和人類患者的原代視覺皮層樣本中增加

5 AD細胞模型和人類患者大腦中ND5蛋白水平降低

由于假設m1A ND5 mRNA甲基化會阻礙Watson-Crick堿基配對，（mt）tRNA在翻譯過程中無法與ND5 mRNA密碼子結合。結合缺陷或缺失將導致失敗或至少破壞ND5蛋白的合成。然而，到目前為止，m1A甲基化與ND5蛋白水平之間的直接相關性尚未得到研究。出于這個原因，作者在AD細胞模型和AD患者的樣本中進行了ND5的WB，以驗證假設（iii）。

在HEK-APPwt細胞中，與對照細胞相比，ND5蛋白水平顯著降低（圖4A），表明m1A對ND5蛋白生物合成具有破壞性。同樣，在NBB樣品中，未檢測到ND5蛋白水平的顯著變化（圖4B）。然而，與錯配結果類似，當將患有Braak 5+6期的AD患者與患有Braak 0-3期的對照組進行比較時，觀察到ND5的蛋白表達顯著降低（圖4B，C）。為研究ND5蛋白水平的改變是否可能是由于ND5 mRNA水平的降低，作者在AD細胞模型和死后組織中進行了RT-qPCR。與對照組相比，沒有觀察到HEK APPwt細胞的ND5 mRNA水平差異（圖4D）。在死后組織中，甚至發現所有AD患者的ND5 mRNA水平都有所升高。Braak 5+6期AD患者與Braak 0-3期對照組的療效相似（圖4E，F）。

為進一步評估人類患者ND5的狀態，作者使用AgDemTBI研究的數據，并觀察到AD患者和健康對照組之間沒有顯著差異（圖4G）。不幸的是，在Mathys等人的scRNA-Seq研究中沒有關于ND5 mRNA的信息。

為檢查ND5蛋白表達的變化是否也由Aβ1–42水平升高和氧化應激增強介導，作者用Aβ1-42（100 nM）和H2O2（250μM）處理HEK Ctl細胞24小時。ND5蛋白水平在兩種應激源下均顯著降低（圖4H）。為評估Aβ誘導的氧化應激是否與HEK APPwt細胞中ND5蛋白表達的減少有關，再次使用維生素C（1000μM）作為抗氧化劑。在這種條件下，ND5蛋白的表達得以挽救（圖4I）。

為排除A?可能通過非特異性作用損害復合物I的所有線粒體編碼亞基的翻譯，在HEK-APPwt細胞中檢測ND1蛋白的表達。發現HEK-Ctl細胞和HEK-APPwt細胞之間ND1蛋白表達沒有顯著差異。

圖4：ND5 蛋白水平在 AD 細胞和動物模型以及 AD 患者大腦中降低

6 TRMT10C介導的m1A甲基化與ND5蛋白翻譯抑制有關

盡管在幾個AD模型系統和人類患者中，TRMT10C上調，ND5 mRNA的m1A甲基化增加，ND5蛋白水平下調，但這些發現之間的假定因果關系需要進一步證實。因此，作者使用四環素誘導的過表達TRMT10C的HEK293細胞系統（pTRMT10C）來仔細研究這一假設（iv）。首先關聯了24小時后0.1和1μg/mL四環素對TRMT10C蛋白表達和m1A ND5 mRNA甲基化的影響（圖5A）。為排除四環素本身的影響，作者還研究了0.1和1μg/mL四環素在相應對照細胞系（Ctl）中的影響。在pTRMT10C細胞中觀察到對TRMT10C蛋白表達的濃度依賴性影響，重要的是，這也與m1A mRNA甲基化相關（圖5B）。

為確定mRNA甲基化增加是否導致ND5蛋白合成減少，作者使用1μg/mL四環素24小時，以誘導強大的TRMT10C蛋白過表達和相應的ND5 m1A甲基化。與用四環素孵育的對照細胞相比，pTRMT10C細胞中ND5蛋白水平顯著降低（圖5C）。與上述分析一致，SDR5C1和PRORP蛋白表達不受TRMT10C過表達的影響（圖5D，E），ND5 mRNA表達也不受影響（數據未顯示）。此外，發現TRMT10C單獨增加不會導致（mt）tRNA水平的任何變化，鑒于在pTRMT10C細胞與1μg/ mL四環素孵育后，線粒體和胞質tRNA之間的比率保持不變。此外，未觀察到（mt）tRNA中m1A和m1G水平的改變。 

圖5：四環素誘導的TRMT10C過表達及其對m1A、ND5、SDR5C1、PROP蛋白水平和線粒體功能的影響

7 TRMT10C過表達誘導嚴重的線粒體損傷

因為TRMT10C誘導的ND5 mRNA中的m1A甲基化降低了ND5蛋白水平，接下來，作者評估了這種降低的ND5蛋白表達是否足以誘導線粒體功能障礙。因此檢測了四環素誘導TRMT10C后的線粒體功能。

首先使用Seahorse XFe 96細胞外流量分析儀，并將耗氧率（OCR）與對照細胞進行比較。首先注射寡霉素以抑制ATP合成酶，影響ATP的產生。接下來的注射是FCCP，通過ATP產生的氧攝取解耦來評估最大呼吸能力。最后，注射魚藤酮和抗霉素來抑制復合物I和III，以估計非線粒體呼吸。代表性圖表如圖5F所示。值得注意的是，與同樣用四環素處理的對照細胞相比，pTRMT10C細胞中的基礎呼吸顯著減少（圖5F）。

為進一步驗證這一發現，作者使用OROBOROS Oxygraph-2k進行了高分辨率呼吸測定，這證實了與對照相比，用四環素孵育的pTRMT10C細胞中的電子傳輸系統容量降低（圖5G）。與此一致，在TRMT10C過表達的細胞中，通過TMRM染色定量的線粒體膜電位降低（圖5H）。

8 功能喪失實驗驗證從TRMT10C到ND5蛋白表達的因果鏈

作者之前的實驗確定了TRMT10C表達增加對mRNA甲基化、ND5水平和呼吸的影響。為了支持將這些觀察結果聯系起來的分子機制的假設，作者使用RNAi降低了TRMT10C水平。

與擾亂的陰性對照和未處理的HEK APPwt細胞相比，siRNA將TRMT10C蛋白表達強烈降低至30%（圖6A）。這種擊倒導致m1A引起的失配和跳躍率的降低（圖6B，C）。ND5蛋白表達顯著恢復（圖6D）。作者沒有觀察到Aβ1-40水平的變化（圖6E，F）。

圖6：siRNA誘導TRMT10C敲低及其對m1A錯配和跳躍率以及mt-ND5蛋白水平的影響

結論：

作者研究了TRMT10C介導的ND5 mRNA甲基化可能導致AD復雜I功能障礙的假說。TRMT10C蛋白在AD中的表達通過ROS依賴性措施增強，導致m1A ND5 mRNA甲基化累積，從而降低ND5蛋白的表達。此外，TRMT10C蛋白表達增強會導致線粒體功能受損，這反映在線粒體呼吸和膜電位降低上。通過這項研究，作者描述了一種全新的轉錄后機制，即復雜I蛋白在AD中的表達和功能是如何減少的

實驗方法：

細胞培養，基因敲低，ELISA，WB，RT-qPCR，線粒體功能測試，線粒體分離，線粒體tRNA分離

參考文獻：

J?rg M, Plehn JE, Kristen M, Lander M, Walz L, Lietz C, Wijns J, Pichot F, Rojas-Charry L, Wirtz Martin KM, Ruffini N, Kreim N, Gerber S, Motorin Y, Endres K, Rossmanith W, Methner A, Helm M, Friedland K. N1-methylation of adenosine (m1A) in ND5 mRNA leads to complex I dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 2024 Jan 29. doi: 10.1038/s41380-024-02421-y. Epub ahead of print. PMID: 38287100.