骨質疏松癥以骨密度降低、骨脆性增加和骨折易感性增加為特征，反映了破骨細胞骨吸收超過成骨細胞骨形成的不平衡，并加速骨轉移。原發性骨質疏松發生在衰老過程中，尤其是絕經后女性。繼發性骨質疏松與原發性骨質疏松的結局相同，但由某些疾病或藥物引起。在這兩種情況下，過度的破骨細胞生成起著關鍵作用，并為治療干預提供了機會。破骨細胞是一類多核巨細胞（MGC），起源于單核/巨噬細胞譜系，負責骨基質和礦物質的吸收。破骨細胞的生成由巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）啟動，誘導破骨細胞標志物如組織蛋白酶K（CTSK）和酸性磷酸酶5（ACP5，也稱為TRAP）的表達，隨后破骨細胞前體成熟和細胞-細胞融合。作為破骨細胞生成的主要調節因子，活化T細胞核因子1（NFATC1）被RANKL誘導，進而與其他轉錄因子形成復合體，激活其編碼基因以及其他參與破骨細胞黏附、細胞融合和骨吸收的基因的轉錄。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200個核苷酸且不翻譯成蛋白質的轉錄本，通過與DNA、其他RNA和蛋白質結合發揮功能。lncRNA通常進化保守性較低。MALAT1是一個高度保守的核內長鏈非編碼RNA，在的組織中大量表達。根據siRNA敲低培養細胞系的結果，MALAT1已被證明調節選擇性前體mRNA剪接。然而，目前缺乏MALAT1改變在低BMD和骨質疏松中發揮作用的功能證據。該研究發表在《Nature Communications》，IF：16.6。

技術路線：

主要研究結果：

1. MALAT1在人類和小鼠破骨細胞分化過程中下調

         CMPs可分化為單核細胞和巨噬細胞，是破骨細胞的前體。作者分析了人胎盤CD14+巨噬細胞向MGCs分化過程中的基因表達（圖1a），其中破骨細胞是的主要細胞群。與CD14+巨噬細胞相比，MGCs中破骨細胞標志物的表達升高，包括NFATC1、CTSK、DCSTAMP、ATP6V0D2、ATP6V0E2和ATP6V0A1（圖1b，c）。相反，相對于CD14+巨噬細胞，MALAT1在MGCs中顯著下調（圖1a-c）。與破骨細胞的功能一致，基因集富集分析表明，與CD14+巨噬細胞相比，在MGCs中富集的基因集與膠原組織、細胞外結構重塑和骨骼發育相關（圖1d）。為了進一步驗證Malat1在巨噬細胞向破骨細胞分化過程中的下調，作者用可溶性RANKL處理小鼠巨噬細胞/前破骨細胞細胞系RAW264.7，以誘導破骨細胞分化。在此處理后，破骨細胞的標志物，包括NFATC1，Ctsk和Trap5，以時間依賴性的方式上調（圖1e-g），而Malat1的表達水平顯著降低（圖1h）。綜上所述，這些結果揭示了MALAT1作為一個lncRNA在人類和小鼠的破骨細胞生成過程中下調。

         脂多糖（LPS）和TNF-α參與病理性破骨細胞生成。與之前的報告一致，作者觀察到單獨的LPS處理不足以啟動破骨細胞分化；相反，當RAW264.7細胞用RANKL預處理時，LPS處理促進了破骨細胞的生成，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色所示（圖1i，j），這是一種廣泛使用的破骨細胞標志物（圖1k），并上調了NFATC1和Ctsk的表達（圖1k）。另一方面，TNF-α可以通過依賴和不依賴RANKL的方式誘導破骨細胞分化。事實上，作者發現用TNF-α處理RAW264.7細胞誘導的破骨細胞生成和NFATC1和Ctsk的表達，無論是否用RANKL預處理（圖1i，l，m）。值得注意的是，Malat1在LPS或TNF-α誘導的破骨細胞分化過程中顯著下調（圖1k，m）。這些發現表明，Malat1可能參與對各種刺激做出反應的破骨細胞生成。

圖1 MALAT1在破骨細胞分化過程中表達下調

2. 遺傳模型顯示Malat1可預防骨質疏松和骨轉移

         為了研究Malat1在破骨細胞生成和骨質疏松中的作用，作者使用了作者之前研究中描述的Malat1敲除小鼠模型（Malat1?/?），在Malat1的轉錄起始位點的下游插入一個轉錄終止子，導致Malat1 RNA表達的丟失，而不改變Malat1的鄰近基因的表達水平。此外，作者之前在小鼠中構建了ROSA26基因座的Malat1轉基因靶向表達（Malat1Tg/Tg)，這使作者能夠通過產生Malat1?/?；Malat1Tg/Tg動物，在Malat1?/?小鼠中進行遺傳拯救研究。作者收集了Malat1+/+，Malat1?/?，Malat1?/?小鼠的各種組織，包括骨髓，胃，結腸，小腸，肝臟和胰腺組織；Malat1Tg/Tg小鼠，通過qPCR檢測Malat1的表達水平。

         通過對6個月大的動物進行股骨微計算機斷層掃描（μCT）分析，作者發現雄性和雌性Malat1?/?小鼠的骨密度比年齡和性別匹配的Malat1+/+小鼠低得多；重要的是，這種骨質疏松表型在Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中得到了挽救（圖2a，b）。μCT數據的定量顯示，與Malat1+/+小鼠相比，骨小梁密度（圖2c，d）在Malat1?/?小鼠中顯著減少，并且這些減少在很大程度上被Malat1表達的遺傳恢復所逆轉（圖2c，d）。TRAP染色顯示，與Malat1+/+小鼠相比，Malat1?/?小鼠股骨中破骨細胞顯著增加，并且這種增加在Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中被逆轉（圖2e）。股骨破骨細胞的定量分析顯示，相對于Malat1+/+小鼠，每骨周長的破骨細胞數量顯著增加（圖2f）和每骨表面的破骨細胞表面（圖2g）在Malat1?/?小鼠中升高約2倍。

         接下來，為了確定Malat1在調節骨病理性丟失中的作用，作者使用了一個成熟的炎癥性骨吸收小鼠模型，包括向顱骨皮下注射LPS。μCT成像顯示，與Malat1+/+或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠相比，給8周齡的Malat1?/?小鼠注射LPS后，顱骨表面的骨質破壞顯著加重（圖2h，i）。TRAP染色和定量顯示，注射LPS后，Malat1?/?小鼠的每骨周長有更高的破骨細胞數量（圖2j，k）和更多的破骨細胞表面每骨表面（圖2j，l），Malat1+/+或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠。綜上所述，這些發現表明Malat1缺乏促進生理和炎癥條件下的骨質疏松。

圖2 Malat1預防骨質疏松

         未經治療的骨質疏松癥與的癌癥患者骨轉移加速相關。治療骨質疏松的藥物，如抑制破骨細胞介導的骨吸收的雙膦酸鹽，已被用于治療骨疾病，包括骨轉移。為了確定宿主中的Malat1是否對骨轉移具有保護作用，作者將熒光素酶標記的B16F1黑色素瘤細胞注射到6個月大的雄性Malat1+/+，Malat1?/?，或Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠的脛骨中，作者發現宿主中的Malat1缺失顯著加劇了骨轉移，Malat1的重新表達挽救了這一表型。通過活體動物的生物發光成像（圖3a）和解剖的骨骼（圖3b，c），以及骨骼中可見腫瘤的肉眼檢查進行測量（圖3d）。

圖3 Malat1保護黑色素瘤和乳腺腫瘤細胞的骨轉移

         鑒于骨是乳腺癌的常見轉移部位，作者在3個月大的雌性Malat1+/+，Malat1?/?，和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠的脛骨內注射EO771細胞系，EO771細胞系來源于C57BL/6背景下的小鼠乳腺腫瘤。注射2×105熒光素酶標記的EO771細胞后，3組動物在注射當天的生物發光信號基線水平無明顯差異。在研究終點，作者觀察到Malat1?/?小鼠的信號顯著高于Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠（圖3e）。安樂死后，作者收集脛骨進行離體成像（圖3f，g），證實了在體成像結果。作者還對脛骨進行了x線成像，發現Malat1?/?小鼠有更多的溶骨性病變（圖3h）。此外，骨切片的he染色顯示，Malat1?/?小鼠的脛骨中有更高的腫瘤負荷，證據是靠近生長板的骨皮質中有更多的癌變，腫瘤區域更深地延伸到遠端骨髓腔（圖3i）。免疫組織化學染色RFP（與熒光素酶共表達）支持組織學分析（圖3i）。此外，TRAP染色顯示，與Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠相比，Malat1?/?小鼠脛骨中破骨細胞數量增加（圖3j-1）。結合B16F1模型的結果，這些發現共同表明，宿主小鼠中Malat1的缺失加劇了黑色素瘤和乳腺癌細胞的轉移性骨定植。

3. 骨質疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨轉移患者骨組織的單細胞轉錄組分析

         為了評估MALAT1在骨質疏松和骨轉移中的臨床相關性，作者分析了人類骨組織的單細胞RNA-seq數據。數據集包括：GSE190772樣本來自2例乳腺癌骨轉移患者，GSE162454樣本來自6例骨肉瘤患者，以及GSE169396特征為1例非骨質疏松個體和3例骨質疏松患者（髖關節置換術中采集的股骨頭）的骨組織。骨肉瘤和乳腺癌骨轉移常表現出溶骨性特征。

         作者使用“和諧”法去除樣本間的批間效應，隨后應用降維法對基于標記基因的細胞類型進行注釋。這些分析確定了不同患者組的細胞簇特異性轉錄組。然后，作者分析了非骨質疏松個體（圖4a，b）、骨質疏松患者（圖4c，d）、骨肉瘤患者（圖4e，f）和乳腺癌骨轉移患者（圖4g，h）的前破骨細胞（包括單核細胞和巨噬細胞）和成熟破骨細胞中MALAT1的表達。在每組中，與前破骨細胞相比，MALAT1在破骨細胞中的表達水平顯著降低（圖4b，d，f，h）。骨質疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨轉移患者的前破骨細胞和破骨細胞中MALAT1的表達水平顯著低于非骨質疏松個體（圖4i-k）。這些發現表明，破骨細胞中MALAT1表達的降低與骨質疏松和骨病變相關，包括乳腺癌轉移和骨肉瘤。

圖4：骨質疏松癥、骨肉瘤或乳腺癌骨轉移患者骨組織的單細胞轉錄組分析

4. Malat1缺陷通過激活NFATC1促進破骨細胞生成

         由于作者研究中使用的Malat1?/?和Malat1Tg/Tg動物是全身敲除和轉基因小鼠，因此上述觀察到的骨質疏松表型可能是也可能不是破骨細胞前體中Malat1缺失的直接影響。為了解決這個問題，作者從Malat1+/+，Malat1?/?，和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg小鼠中分離出原代骨髓來源的巨噬細胞（BMMs），然后用M-CSF和RANKL處理這些破骨細胞前體4-6天，誘導其向破骨細胞分化。qPCR證實了BMMs中的基因消融和Malat1表達恢復（圖5a）。在M-CSF和RANKL誘導分化后，作者通過TRAP染色檢測破骨細胞，發現敲除Malat1導致TRAP陽性多核破骨細胞數量顯著增加，而重新表達Malat1逆轉了觀察到的破骨細胞生成的誘導（圖5b）。破骨細胞標志物Ctsk和Trap5的mRNA水平在Malat1?/?細胞中明顯高于Malat1+/+和Malat1?/?；RANKL處理后Malat1Tg/Tg細胞（圖5c，d）。

圖5 Malat1缺陷通過NFATC1促進破骨細胞生成

         作者還使用CRISPR干擾（CRISPRi）在細胞系中敲低Malat1。選取sgRNA-2和sgRNA-3在RAW264.7細胞中敲低Malat1，并通過qPCR進行驗證（圖5e），得到的兩個敲低Malat1的穩定細胞株分別命名為Malat1 KD1和Malat1 KD2。RANKL誘導分化后，Malat1 KD1和Malat1 KD2細胞比對照RAW264.7細胞產生更多的trap陽性多核破骨細胞（圖5f）。鬼筆環肽和DAPI分別對F-actin環和細胞核進行熒光染色，結果顯示Malat1 KD1和Malat1 KD2細胞的每個破骨細胞的細胞核數量高于對照細胞（圖5g）。此外，在RANKL處理的RAW264.7細胞中，敲低Malat1可以上調Ctsk和Trap5的mRNA水平（圖5h，i）。總的來說，原代骨髓基質細胞和RAW264.7細胞的結果表明，破骨細胞前體中Malat1的缺失促進了RANKL誘導的破骨細胞生成。

         接下來，作者將RANKL刺激時間延長至2天和5天，發現Malat1缺乏不影響Mitf、Erk1/2、c-Fos、IκBα、Creb1和p38的水平。另一方面，與Malat1+/+和Malat1?/?；Malat1Tg/Tg骨髓基質細胞相比，Malat1敲除骨髓基質細胞更多地誘導了NFATC1及其轉錄靶Ctsk（圖5j）。作者在RANKL處理的Malat1 KD1和Malat1 KD2 RAW264.7細胞中觀察到類似的結果（圖5k）。已知NFATC1作為其自身的轉錄因子發揮作用。與Malat1野生型相比，Malat1敲除的BMMs和RAW264.7細胞在RANKL刺激后顯示出更多的NFATC1 mRNA水平的誘導（圖5l，m）。Ctsk，一個經典的NFATC1靶基因，包含兩個NFATC1結合位點在啟動子區域（圖5n）。染色質免疫沉淀-qPCR檢測顯示，在RANKL處理后，Malat1敲低的RAW264.7細胞顯示NFATC1占據了比對照RAW264.7細胞更多的這兩個區域（圖5o，p）。重要的是，在敲低Malat1的RAW264.7細胞中，敲低NFATC1逆轉了RANKL刺激下對破骨細胞生成和Ctsk表達的誘導（圖5q，r）。綜上所述，這些結果表明Malat1缺失通過NFATC1促進破骨細胞分化。

         作者還試圖確定Malat1過表達的影響。Malat1是一種高度富集的lncRNA，作者通過多種方法進行了測試，并僅通過piggyBac轉座子系統和電穿孔在RAW264.7細胞中過表達Malat1。在野生型細胞和小鼠中實現顯著的Malat1過表達的挑戰限制了對其過表達效應的全面研究。然而，考慮到前破骨細胞和破骨細胞中MALAT1表達的減少與骨質疏松和骨轉移相關（圖4i-k），作者的功能缺失方法，再加上MALAT1在MALAT1缺陷小鼠和細胞系中的重新表達，適合于這項研究。

5. Malat1結合TEAD3抑制NFATC1活性和破骨細胞生成

         Malat1如何調控NFATC1與其他蛋白的結合可以激活或抑制NFATC1的轉錄活性，而lncRNA通常通過與蛋白的相互作用來發揮其功能，Malat1已經證明了這種作用模式。作者推測Malat1可能通過與NFATC1和/或其結合蛋白相互作用來調節NFATC1的自動擴增環路，因此作者搜索了蛋白質-蛋白質相互作用數據庫Mentha（http://mentha.uniroma2.it/index.php）。

         作者檢測了4個Tead家族成員在BMMs和RAW264.7細胞以及其他幾種小鼠細胞系中的蛋白水平。有趣的是，Tead1和Tead共激活因子Yap在BMMs和RAW264.7細胞中不可測，但在小鼠黑色素瘤細胞系B16F1、小鼠胚胎成纖維細胞、MSC和小鼠成纖維細胞系L929中大量表達（圖6a）。相反，TEAD3在原發性骨髓基質細胞中表現出相對特異性的表達模式。為了確定前破骨細胞中Malat1是否與NFATC1相互作用，作者進行了RIP檢測，發現Malat1在RAW264.7細胞的pan-Tead和TEAD3免疫沉淀中均富集（圖6b，c），這驗證了在這些破骨細胞前體中Malat1和TEAD3之間的相互作用。為了確定Malat1是否直接結合TEAD3，作者對Malat1的6個非重疊的生物素化片段，作者發現所有6個Malat1片段，而不是一個無關的核RNA U1，都與TEAD3蛋白結合（圖6d），這表明TEAD3結合位點可能彌漫性分布在Malat1上。

圖6 Malat1與TEAD3結合抑制NFATC1活性

         有趣的是，RAW264.7和U937細胞的RANKL處理上調了TEAD3，但沒有上調其他Tead家族成員（圖6e，f）。免疫共沉淀（co-IP）實驗表明，TEAD3，而不是Yap，與NFATC1相互作用（圖6g）。在驗證TEAD3與Malat1和NFATC1的相互作用后，作者試圖確定Malat1是否調節TEAD3與NFATC1的結合。為此，作者產生了Malat1敲除的HEK293T細胞，并將TEAD3和NFATC1轉染這些細胞。Co-IP檢測表明，Malat1缺失顯著增加了TEAD3和NFATC1之間的相互作用（圖6h，i）。為了進一步證實這一結果，作者在Malat1敲除的HEK293T細胞中重新表達Malat1，發現恢復Malat1表達降低了TEAD3-NFATC1的相互作用（圖6j，k）。

         NFATC1蛋白包含四個結構域:n端和c端區域的兩個轉錄激活結構域（TAD）、一個中央DNA結合結構域（DBD）和一個n端調節結構域（圖6l）。TEAD3蛋白主要由兩個結構域組成：n端DBD（也稱為TEA結構域）和c端yap結合結構域。因此，作者產生了NFATC1和TEAD3的截短突變體（圖6l），并進行了co-IP檢測，發現Nfact1的n端區域和中央DBD，而不是Nfact1的c端TAD，可以結合TEAD3（圖6m）。此外，使用TEAD3截短突變體和全長NFATC1進行的co-IP分析表明，TEAD3的TEA結構域，而不是yap結合結構域，負責與NFATC1的相互作用（圖6n）。

         作者進一步研究了Malat1和TEAD3是否調節NFATC1的轉錄活性，通過使用包含串聯NFATC1結合位點或Ctsk啟動子的熒光素酶報告，作者發現TEAD3的過表達確實增強了NFATC1的轉錄活性（圖6o，p）。作者發現，與野生型或Malat1挽救的細胞相比，在Malat1敲除細胞中，TEAD3過表達導致NFATC1活性出現更高的劑量依賴性增加（圖6q，r）。這些結果支持以下模型：Malat1缺失解除對TEAD3的抑制，而TEAD3進而結合并激活NFATC1。

         利用CRISPR激活方法激活RAW264.7細胞內源性TEAD3表達（圖7a、b），作者發現過表達TEAD3促進了破骨細胞分化（圖7c、d），上調了NFATC1、Trap5和Ctsk的表達（圖7e-h）。接下來，作者在RAW264.7細胞中敲低TEAD3（圖7i），發現敲低TEAD3減弱了RANKL誘導的破骨細胞分化（圖7j，k），并下調了NFATC1和Ctsk的表達（圖7l）。此外，在敲除Malat1的RAW264.7細胞中，沉默TEAD3可以抵消RANKL介導的破骨細胞生成和NFATC1和Ctsk表達的誘導（圖7m-p）。因此，Malat1缺失以TEAD3和NFATC1依賴的方式促進破骨細胞分化。

圖7 TEAD3促進破骨細胞生成并介導Malat1缺陷的作用

結論：

         該研究發現Malat1在人類和小鼠的破骨細胞生成過程中下調。值得注意的是，小鼠中Malat1的缺失促進了骨質疏松和黑色素瘤和乳腺腫瘤細胞的骨轉移，而Malat1的基因反加可以挽救這一過程。機制上，Malat1與TEAD3蛋白結合，阻斷TEAD3與NFATC1的結合和激活，從而抑制NFATC1介導的基因轉錄和破骨細胞分化。值得注意的是，臨床骨樣本的單細胞轉錄組分析表明，前破骨細胞和破骨細胞中MALAT1表達的降低與骨質疏松和轉移性骨病變相關。綜上所述，這些發現證實了Malat1是一個可以預防骨質疏松和骨轉移的lncRNA。

實驗方法：

         基因工程小鼠模型，LPS誘導的炎性骨質疏松模型，μCT骨掃描和分析，骨轉移測定，骨組織組織學，TRAP染色，甲苯胺藍染色，免疫組織化學染色，骨組織鈣黃綠素染色，細胞培養，破骨細胞分化，成骨細胞分化，肌動蛋白環染色，質粒，慢病毒轉導，Malat1敲低、敲除和過表達，TEAD3敲低和過表達，RNA干擾，免疫沉淀，免疫印跡，RNA提取，cDNA合成，定量PCR，RT-PCR，染色質免疫沉淀分析，RNA pulldown，RIP，熒光素酶報告基因檢測，酶聯免疫吸附實驗，批量RNA測序分析，單細胞RNA-seq分析

參考文獻：

         Zhao Y, Ning J, Teng H, Deng Y, Sheldon M, Shi L, et al. Long noncoding RNA Malat1 protects against osteoporosis and bone metastasis. Nat Commun. 2024 Mar 16;15(1):2384. doi: 10.1038/s41467-024-46602-3. PMID: 38493144; PMCID: PMC10944492.