單個細胞在多細胞組織中的身份和功能是由血統決定和活動依賴的轉錄因子之間的相互作用確定的，其機制尚不完全清楚。通過構建人胰島內染色質狀態的單細胞圖譜，作者發現由血統決定因子胰十二指腸家族盒基因1（PDX1）的高或低活性所主導的β細胞亞型。PDX1活性降低的β細胞在潛在的核因子kB（NF-kB）增強子上顯示出增加的染色質可及性。Pdx1低活性小鼠在夜間展現了NF-kB的解抑制和葡萄糖耐受力受損。與染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）一起進行的三維分析揭示了PDX1通過涉及SIN3A的長程染色質接觸在晝夜和炎癥增強子上沉默NF-kB。相反，在β細胞中Bmal1基因敲除破壞了全基因組范圍內的PDX1和NF-kB DNA結合。最后，拮抗NF-kB的白細胞介素-1β（IL-1β）受體，改善了Pdx1低活性胰島的胰島素分泌。作者的研究揭示了由PDX1活性梯度定義的單個β細胞的功能亞型，并確定NF-kB是胰島素促分泌療法的靶點。

         該研究于2024年1月發表在《Cell Metab》，IF：29.0。

圖形摘要：

技術路線：   

結果:

1、單細胞染色質可及性測序識別了人胰島中不同β細胞群體內PDX1和潛在NF-kB增強子的特征

         為了闡明血統和活動依賴性轉錄因子之間的組合相互作用如何決定 β 細胞的異質性和功能，作者使用單核酸可及性測序（snATAC-seq）在從集成胰島分發計劃（IIDP）獲得的人類尸體胰島中進行了染色質可及性和轉錄因子結合位點的分析（圖1A）。作者在20,519個單個胰島細胞中鑒定了334,116個可及性 CREs，并使用統一流形逼近和投影（UMAP）降維方法將它們分成19個不同的簇。這19個簇包括規范內分泌細胞類型，其中有四個α 細胞簇（a1–4）、三個β 細胞簇（b1–3）和一個δ 細胞簇（圖1B），分別以染近編碼葡萄糖素（GCG）、胰島素/胰島素樣生長因子2（INS/ IGF2）和生長抑素（SST）的基因附近的染色質可及性為特征（圖1C）。通過在規范細胞標記的可及性確定的其他胰島相關細胞亞群包括星狀細胞（PDGFRB）、神經嵴細胞（SOX10）、淋巴和髓系免疫細胞（CCL4）、內皮細胞（PECAM1）、導管細胞（KRT19）和腺泡細胞（REG1A）（圖1B和圖1C）。

         snATAC-seq相較于單細胞mRNA轉錄組學分析的一個關鍵優勢在于其能夠檢測轉錄因子在基因啟動子和遠端增強子上的調控活性。為了檢查是否差異基因調控潛在地支持了β細胞的異質性，作者首先比較了b1和b2 β細胞亞簇之間的基因活性分數。這兩個亞簇分別占總β細胞數量的47.2%和45.1%。作者發現了600個具有顯著變異（p < 0.05）的基因，其中包括β細胞定義基因，如INS（6.45e-87）、MAFA（2.25e-50）和GLP1R（2.37e-36），以及炎癥基因，如PTGER3（1.471551e-05）、IL2（5.968259e-15）和LPAR1（8.646495e-15）。使用snATAC-seq基因活性分數作為Seurat中的聚類傳遞錨點，對來自12個非糖尿病人類胰島的單細胞RNA測序（GEO: GSE114297）進行分析，揭示了β1和β2亞群之間的RNA表達的log2-fold變化與染色質基因活性分數之間存在顯著相關性。這些數據揭示了跨細胞類型的單細胞轉錄豐度和染色質可及性之間的對應關系。

         為了闡明影響β細胞異質性的表觀遺傳機制，作者使用chromVAR識別β1與β2亞群之間的差異TF活性，以測量與TF相關的染色質可及性。比較β1和β2細胞簇之間的motif Z 分數，發現在幾個β細胞LDTF（Lineage-Determining Transcription Factor）的motif上存在差異可及性，這與靠近INS基因的可及性增加相對應（圖1D）。在已知的LDTF中，PDX1，胰腺發育的主要調控因子之一，是差異富集motif中最顯著的之一，同時也是成熟β細胞中表達最高的TF之一（圖1D、圖1E）。作者進一步發現，在β1和β2細胞之間的差異可及性位點中，有58%的位點包含PDX1的motif，而在背景峰值集合中只有40%。因此，作者將這些β1和β2亞群分別稱為PDX1高和PDX1低細胞。在PDX1高細胞中富集的其他TF包括已知在成熟β細胞發育中所需的NEUROD1、NKX6.1和bHLH胰腺轉錄因子1A（PTF1A），以及其他bHLH TF，其DNA結合motif包含分子時鐘的靶標經典E-box motif（圖1E）。相反，具有在INS位點低可及性的β2細胞亞簇在可及性上高度富集了可及性NF-kB1、kruppel樣因子KLF14、JUNB和干擾素調節因子6（IRF6）的TF motif（padj < 0.001）（圖1E），這些TF在應激、免疫應答、細胞增殖和存活期間調控炎癥基因的信號誘導表達?？偟膩碚f，作者對染色質活性的單細胞測序揭示了人類胰島內胰島素產生細胞的雙峰分布，其中一個是INS豐富簇，具有高PDX1活性，另一個是INS低簇，具有低PDX1活性，但具有NF-kB TF活性的顯著富集。

         作者的數據表明， PDX1和時鐘調控元素在INS豐富簇中共存，支持了PDX1和節律基因表達可能在β細胞功能中發揮作用的可能性。為了檢查β細胞身份的轉錄調控因子是否以晝夜節律方式調控，作者通過在人類胰島中進行ATAC-seq來評估染色質的24小時節律開放，首先使用1小時的 forskolin 脈沖同步其分子時鐘。在forskolin給藥后的24小時內，每4小時進行一次基因組分析，遠遠超過 forskolin 對染色質作用的約1小時半衰期（圖1A）。作者在24小時時間序列內生成了每個捐贈者的Z分數，使用標準化的ATAC-seq計數，并使用經驗Jonckheere-Terpstra-Kendall算法（eJTK_CYCLE）鑒定了全基因組的3,125個統計學上有節律的ATAC-seq峰值（圖1F）。這些有節律的位點位于與胰島細胞身份（SIX3、PDX1和GCG）、晝夜表達（PER2和NPAS2）以及炎癥（ETS2和TNFRSF21）有關的基因的增強子附近。在有節律的ATAC-seq峰值處進行的TF motif富集分析表明，在TFs方面存在顯著的富集（例如，PDX1、NEUROD1和PTF1A）（padj < 0.05）（圖1F），這些TFs也在PDX1高細胞中富集（圖1E）?？傮w而言，這些研究表明，PDX1和其他TF在一天中的有節奏共同激活染色質可能有助于β細胞的功能。

2、PDX1通過抑制NF-kB增強子來調控β細胞功能

         轉錄因子之間的相互作用在基因組的非編碼調控區域內推動內分泌胰腺的身份和功能?；谠谡宫F差異NF-kB和時鐘活動模式的不同細胞群中發現PDX1活性特征的發現，作者試圖通過對具有PDX1基因遺傳缺陷的小鼠胰島進行snATAC-seq分析（圖2A）來剖析PDX1在控制炎癥和晝夜基因網絡中的功能。由于Pdx1基因敲除導致胚胎致死，作者利用攜帶Pdx1關鍵調控增強子（區域IV）內突變的第二等位基因（突變體Pdx1?AIV/-）的雜合小鼠，其與對照的Pdx1+/-小鼠相比，發育后期表現出低胰島素血癥、葡萄糖耐量受損和減少的β細胞增殖（圖2A）。使用從Pdx1?AIV/-和對照Pdx1+/-小鼠在斷奶后（10–18周齡）收集的核酸單體數據，作者鑒定了來自9,480個單個胰島細胞的187,343個可及性CREs，并將其分為15個獨特的胰島細胞亞群，其中包括三個β細胞亞群（圖2B）。這三個小鼠β細胞亞群的PDX1活性變化與作者在人類尸體胰島中的觀察相似（圖1B–1E）。比較Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/-基因型的所有三個β細胞亞群中染色質可及性的集合，揭示了在1,373個唯一基因上的1,902個染色質峰值的顯著改變。Pdx1區域IV增強子區域是最顯著的下調非編碼CRE，與該增強子的半合子性一致，其次是Ins1啟動子（圖2C）。來自匯總的β細胞亞群的motif分析顯示，在促進β細胞功能的關鍵轉錄因子結合位點上，Pdx1?AIV/-突變小鼠中的染色質可及性減少，包括NEUROD1、NEUROG2、PTF1A和bHLH因子（圖2D），這提供了遺傳證據，支持作者在人類胰島中的發現，即PDX1高亞群與與β細胞和晝夜功能相關的轉錄因子相關（圖1E和圖1F）。相反，在Pdx1缺陷突變體中染色質可及性增加的位點含有與促炎信號有關的轉錄因子結合位點，包括NF-kB1、NF-kB2和RELA（圖2D）。在Pdx1?AIV/-缺陷突變體中檢測到染色質景觀的改變，其中促炎增加，胰島素分泌網絡減少，類似于作者在富含或貧乏PDX1和NF-kB的人類胰島中觀察到的唯一增強子簽名（圖1E和圖1F）。基因本體路徑分析進一步指示了PDX1在誘導β細胞中糖應答性胰島素分泌的基因以及同時抑制促炎調控元件方面的作用（圖2E）。

3、晝夜節律分析揭示了PDX1對NF-kB增強子活性的節律調控

         觀察到來自Pdx1缺陷動物的胰島在與晝夜節律轉錄因子結合的增強子內顯示致密染色質的現象（圖2E），促使作者檢查Pdx1缺陷對β細胞增強子的時間調控的影響。為了檢查Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/-對照小鼠胰島在內在晝夜周期的兩個不同階段的染色質可及性，作者將胰島暴露于1小時的 forskolin 脈沖，并在節奏性胰島素分泌的最低點和最高點收集胰島（圖3A）。作者按照適用于低輸入樣本的Omni-ATAC-seq協議進行ATAC-seq，并在所有混合樣本中鑒定了132,195個唯一的可及性位點（圖3A）。似然比檢驗（LRTs）使用DESeq2中的規范化ATAC-seq計數數據，以確定在與晝夜時間或Pdx1基因型相關方面，有1,207個顯著改變的CREs（圖3B和圖3C）。使用這些數據在這些位點的規范化ATAC-seq計數進行的無偏主成分分析顯示了與基因型和晝夜時間相關的染色質開放的不同模式。

         為了在這些數據中識別這些數據之間的染色質可及性調控模式，作者進行了k均值聚類，并識別出依賴于晝夜時間和/或基因型的三個不同基因簇。group 1位點在Pdx1缺陷的胰島中在兩個時間點上的可及性減少，但在對照的胰島中在CT48時更為顯著地開放，而group 2位點在CT36時具有特異性的可及性增加，并且在Pdx1缺陷的胰島中更為可及性增加（圖3B和圖3C）。group 3位點僅受晝夜時間的調控，而不受基因型的調控。與時鐘和PDX1在促進胰島素分泌方面的協同作用有關，group 1位點富集有PDX1、MAFA和NKX6.1結合位點，包括促進Ins1和Mafa表達的經典PDX1 CREs（padj < 0.001）（圖3B和圖3C）。相反，在group 2峰集內富集在Pdx1缺陷細胞中發生的ATAC-seq峰，出現在與炎癥介質Tnfrsf11b、Nfkbiz、Il-1b以及E26轉換特異性（ETS）因子Etv1和Ets2相關的位點（圖3B–3D），并在NF-kB、RELA以及即刻早期復合物FOS::JUNB的結合位點中富集（圖3C）。這些發現表明，Pdx1的喪失導致炎癥和應激反應基因的去抑制和節奏性重編程。在Pdx1缺陷的胰島中，編碼α-細胞富集的腎上腺素受體ADRB1和ADRA1b的基因也表現出增加的晝夜變異性，表明PDX1正常通過可能涉及晝夜因素的機制抑制胰島α細胞轉錄（圖3B–3F）。值得注意的是，Pdx1?AIV/-突變體中的淋巴、巨噬細胞和外分泌細胞未顯示出差異的PDX1活性，表明group 2基因的增加染色質可及性不能歸因于非β細胞類型的信號。最后，與group 1和group 2相反，group 3的染色質可及性僅依賴于晝夜時間（圖3B、）。這些位點富集有D盒結合蛋白（DBP）。

         為了確定在作者的同步ATAC-seq數據集中確定的差異染色質特征是否對應于整體動物的晝夜胰島素分泌動力學，作者在Pdx1?AIV/-突變體和Pdx1+/異型對照小鼠中進行了口服葡萄糖耐量試驗（oGTTs），分別在白天（白天 ）和夜晚（ZT14）進行。與對照小鼠相比，Pdx1?AIV/-突變小鼠顯示出明顯受損的葡萄糖耐量（p < 0.0001），在夜間更為明顯（圖3E）。通過混合效應建模分析整體葡萄糖曲線，還發現Pdx1基因型、一天中的時間和葡萄糖水平之間存在顯著的相互作用。與對照組相比，這些小鼠在兩個時間點的胰島素和C肽水平均顯著降低（圖3E），而在突變體中，晚上的胰島素和C肽水平降低的幅度更大?？傮w而言，這些數據揭示了PDX1在整個白天通過改變分泌和促炎基因網絡的控制來調節染色質緊縮、β細胞成熟和葡萄糖穩態的需求。

         為了檢查分子時鐘是否通過控制PDX1染色質結合而對節律胰島素分泌有貢獻，作者在Bmal1敲除（KO）小鼠β細胞系（Beta-TC-6）中進行了PDX1 ChIP-seq。作者發現BMAL1的喪失在β細胞中顯著降低了PDX1 DNA結合的全基因組水平，包括在控制與胰島素分泌調節相關的基因表達的區域，如Ins1、Neurod1和Six2。因此，分子時鐘的喪失導致了PDX1調節與β細胞功能相關的基因的互相受損。

4、PDX1形成長程染色質環以調控NF-kB和晝夜節律時鐘增強子活性

         鑒于作者的觀察到PDX1和NF-kB調控元素區分了成年β細胞的不同亞群（圖1和2），作者試圖確定PDX1是否直接全基因組抑制NF-kB。作者首先研究了PDX1耗竭如何影響p65的活性，p65是一個經典的NF-kB亞單位，使用針對PDX1的小干擾RNA（siRNA）和對照siRNA在Beta-TC-6中進行了48小時處理，并使用p65 ChIP-seq進行比較（圖4A）。作者觀察到PDX1的喪失在5,268個獨特位點上增加了p65的全基因組占有率，盡管p65蛋白水平相似（圖4A）。這種結合的增加包括NF-kB/炎癥靶點，如Tnfrs11a，以及編碼晝夜節律抑制子PER2的基因（圖4A），與先前的研究一致。發光度分析顯示，Pdx1低表達的胰島表現出縮短的周期長度。因此，β細胞中PDX1的喪失增加了NF-kB的全基因組結合，并改變了核心時鐘抑制子的表達，這表明PDX1對NF-kB的抑制反過來改變了時鐘功能。

         三維染色質分析揭示了LDTFs在廣泛分離的基因組區域之間形成聯系，以控制β細胞功能，但是是否PDX1通過遠程聯系來控制SDTFs尚未確定（圖4B）。在Pdx1-knockdown β細胞中，p65結合位點富集在距離（>500 bp）PDX1在對照細胞類型中觀察到的DNA結合位點較遠的位置。因此，作者利用三維染色質構象捕獲結合PDX1 ChIP-seq（HiChIP-seq）的方法來映射PDX1與遠離的調控元件之間的遠程相互作用（圖4B）。作者鑒定了4,155個長程（>5 kb）染色質相互作用，涉及PDX1與遠離的順式調控區域之間的相互作用（圖4C）。其中包括497個細胞因子誘導的、NF-kB結合位點，這些位點在IL-1b處理的β細胞中被p65 ChIP-seq鑒定為NF-kB靶點。值得注意的是，在這些環中，IL-1b誘導的p65峰值的比例比作者的小鼠胰島ATAC-seq peak集中所有可訪問CREs中NF-kB基序的背景發生率高3倍。在PDX1染色質環中，觀察到一個顯著的環，位于距離腫瘤壞死因子（TNF）受體相關因子3相互作用蛋白1（Traf3ip1）2.1 kb的PDX1結合位點上游和Per2基因的50 UTR內的NF-kB結合位點之間（圖4C）。為了測試PDX1是否通過招募共抑制復合物在這些遠離的增強子處抑制NF-kB，作者進行了帶有轉錄共抑制劑SIN3A的染色質免疫沉淀實驗，SIN3A與PDX1共同建立β細胞身份。在4,925個SIN3A結合位點中，有41%與PDX1調控的基因共定位，包括Traf3ip1和TNF相關基因，如Tnfsf4和Traf5（圖4C）。此外，作者發現PDX1的喪失在全基因組范圍內破壞了SIN3A染色質結合，包括在靠近編碼Nfkbie的基因附近的IL-1b誘導的NFkB結合位點上降低了SIN3A的結合。

5、使用IL-1β受體拮抗劑抑制NF-kB信號可以增強PDX1缺陷的β細胞功能

         人類PDX1低表達和小鼠Pdx1DAIV/缺陷β細胞均表現出在促炎網絡和NF-kB靶點（如IL-1b）上增加染色質開放性的特征（圖1和2）。IL-1受體（IL-1R）是胰島β細胞中表達最高的細胞因子受體之一。暴露于IL-1b可重塑β細胞染色質景觀，而IL-1b的拮抗在人類中代表了一種成熟的抗炎策略。炎癥似乎也通過機制在2型糖尿病的β細胞功能障礙中起作用，盡管具體機制尚不明確。作者發現，IL-1b刺激野生型小鼠的β細胞導致經典NF-kB靶點（包括Nfkbiz和Nfkbia）的表達增加，并抑制了PDX1靶點（包括Mafa、Glp1r和Pdx1本身）的表達（圖4D）。IL-1b還抑制了野生型Beta-TC-6細胞的葡萄糖刺激的胰島素釋放（圖4E）。相反，使用IL-1b受體拮抗劑（IL-1RA）處理從Pdx1DAIV/缺陷小鼠中分離的胰島，顯著增強了胰島素分泌（圖4G），與通過阻斷IL-1b誘導的NF-kB信號來治療PDX1缺陷的療效相一致。總體而言，作者的表觀基因組和遺傳研究表明，在與PDX1和/或時鐘功能相關的β細胞失效狀態中，阻斷NF-kB上游的炎癥可能提供一種新型的胰島素促分泌療法。

 實驗方法：

         snATAC-seq、RNAscope多重分析、Bulk ATAC-seq、ChIP-seq、HiChIP-seq、RNA-seq、Pdx1 敲低、WB、胰島素分泌測定、LumiCycle 分析。

參考文獻：

         Weidemann BJ, Marcheva B, Kobayashi M, et al. Repression of latent NF-κB enhancers by PDX1 regulates β cell functional heterogeneity. Cell Metab. 2024;36(1):90-102.e7.