結直腸癌（CRC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別居所有惡性腫瘤的第3位和第2位。腫瘤轉移是結直腸癌患者死亡的主要原因。臨床上約有45-60%的CRC患者存在肝轉移，超過90%的肝轉移灶在初診時無法切除。未行手術治療的結直腸癌肝轉移患者的中位生存時間僅為6.9個月，5年生存率低于5%。因此，破譯結直腸癌肝轉移的機制，發現新的治療靶點，預防和干預轉移，提高患者生存率具有重要的臨床意義。環狀RNA（circRNA）是一類特殊的內源性RNA分子，具有共價閉合環狀結構，由剪接體催化的反向剪接事件產生，一個基因位點可以產生一個或多個circRNA。高通量測序和計算機模擬方法已經確定circRNA高度保守，并以疾病、組織或細胞特異性模式廣泛表達。circRNA越來越多地參與各種人類疾病的發生和發展，一些circRNA被確定為預測疾病進展和預后的生物標志物。有趣的是，最近的一些證據表明，circRNA可以被翻譯成功能性肽。例如，circRNA編碼的截短蛋白如E-Cad-254aa和ARHGAP35-1289aa已被報道分別在膠質瘤和肝細胞癌中發揮關鍵作用。由于circRNA的頭尾形狀，其編碼蛋白質的方式不依賴帽，由內部核糖體進入位點（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修飾驅動。m6A是真核生物RNA中最豐富的內部修飾，它是動態可逆的。到目前為止，只有少數隱藏在circRNA中的內源性小蛋白被表征，絕大多數的功能相關性還有待發現。該研究發表在《Molecular Cancer》，IF：37.3。

技術路線：

主要研究結果：

1. Circ-YAP與結直腸癌肝轉移相關

         為了鑒定在結直腸癌肝轉移中具有翻譯活性的關鍵circRNA，研究者分析了circRNA微陣列和核糖體新生鏈復合體結合RNA測序數據。接下來，檢測了circ-YAP在新鮮冷凍組織中的表達，結果顯示，與正常組織相比，circ-YAP在CRC組織中輕度升高，而在肝轉移病例中顯著過表達（圖1A）。同樣，在高轉移潛能的CRC細胞系中也觀察到高circ-YAP（圖1B）。序列分析顯示，circ-YAP來源于YAP前體mRNA第2、7外顯子的反剪接，成熟全長為842 bp（圖1C）。在正常和CRC細胞中，Circ-YAP對RNAse R消化均有抗性（圖1D），而其線性異構體則無抗性(圖1E)。此外，Circ-YAP的半衰期超過24h（圖1E）。qRT-PCR和FISH檢測結果顯示，circ-YAP主要定位在細胞質中（圖1F）。為了進一步探索circ-YAP的臨床相關性，研究者收集了石蠟包埋組織，采用ISH檢測circ-YAP的表達。與預期一致，circ-YAP在結直腸癌肝轉移組織中顯著上調（圖1G，H），曲線下面積（AUC）值為0.8433（圖1I）。更重要的是，高circ-YAP患者的生存時間比低circ-YAP患者短（圖1J）。綜上所述，這些數據表明，circ-YAP是一個真正的circRNA，可能用作CRC肝轉移的一個有前景的指標和預后標志物。

圖1 circ-YAP在結直腸癌肝轉移組織中的鑒定

2. 敲低circ-YAP可減輕結直腸癌肝轉移負荷

         為了研究circ-YAP的生物學功能，研究者使用CRISPR/Cas13d技術沉默circ-YAP。如圖2A所示，設計的3種gRNA均能有效敲低circ-YAP，但不影響YAP mRNA的表達。劃痕實驗和transwell實驗顯示，沉默circ-YAP顯著抑制LoVo細胞的遷移（圖2B，C）和侵襲（圖2D，E）。接下來，研究者在circ-YAP低表達的CRC細胞中過表達circ-YAP（圖2F），結果顯示，circ-YAP過表達后細胞遷移和侵襲能力顯著增強（圖2G，H）。通過在NOD/SCID小鼠的腸壁內注射TC71 PDX細胞建立自發性結直腸癌肝轉移PDX模型（圖2I）。10周后，對照組50%的小鼠發生了肝轉移，而circ-YAP沉默組只有6.7%的小鼠發生了肝轉移（圖2J，K）。綜上所述，這些數據表明circ-YAP在CRC細胞侵襲性和肝轉移中起著至關重要的作用。

圖2 沉默circ-YAP可減輕結直腸癌肝轉移負荷

3. Circ-YAP編碼YAP蛋白異構體YAP-220aa

         通過序列比對，研究者發現circ-YAP包含一個潛在的跨越ORF連接位點，編碼220-aa蛋白（圖3A，B）。為了驗證circ-YAP是可翻譯的，研究者在circ-YAP過表達載體中添加Flag標簽；其中，circ-YAP的連接位點被移動到ORF的終止密碼子，Flag序列被一分為二，位于circ-YAP的兩側（圖3C）。轉染HEK293T細胞后，flag tag抗體檢測到約26 kDa的條帶（圖3D）。考馬斯亮藍染色顯示，過表達circ-YAP后，這一條帶更加明顯，隨后，通過質譜分析驗證了YAP-220aa的獨特氨基酸序列（圖3E）。接下來，研究者制備了特異性靶向YAP-220aa的兔多克隆抗體，并證實其能有效檢測內源性YAP-220aa蛋白（圖3F）。鑒于circRNA的翻譯是由IRES或m6A修飾驅動的，研究者首先評估了IRES對circ-YAP的翻譯活性。值得注意的是，在翻譯起始位點的近端發現了一個高度保守的m6A位點“GGACA”（圖3B）。腺嘌呤突變為胞嘧啶后（圖3C），YAP-220aa蛋白幾乎無法被抗flag抗體檢測到（圖3D），這意味著m6A對circ-YAP翻譯至關重要。YAP-220aa主要定位于細胞質（圖3G），并且在高轉移CRC細胞中過表達（圖3H）。同樣，沉默METTL3顯著降低了內源性YAP-220aa的表達（圖3I），并且與低轉移的CRC細胞相比，高轉移的CRC細胞中circ-YAP的m6A富集更多（圖3J）。功能上，過表達circ-YAP增強了HT29和SW480細胞的遷移和侵襲，這些作用被m6A突變阻斷（圖3K，L）。此外，實驗肝轉移模型顯示，野生型circ-YAP增加了CRC細胞在體內的肝轉移（圖3M），而m6A突變型circ-YAP沒有增加（圖3M）。綜上所述，這些發現表明circ-YAP的功能是通過翻譯成一個新的YAP蛋白亞型，這是由m6A修飾介導的。

圖3 Circ-YAP編碼由m6A介導的YAP-220aa

4. 翻譯circ-YAP需要m6A閱讀器YTHDF3

         研究者想知道哪些m6A閱讀蛋白參與了circ-YAP翻譯過程。如圖4A所示，敲低YTHDF3，而不是YTHDF1/2，顯著阻斷了由circ-YAP過表達引起的YAP-220aa水平升高（圖4A）。為了進一步驗證YTHDF3對circ-YAP翻譯的影響，研究者利用CRISPR/Cas9技術構建了YTHDF3敲除的CRC細胞株。結果表明，在YTHDF3?/?LoVo和SW620細胞中無法檢測到p-circ-YAP-Flag的翻譯產物（圖4B，C）。相反，YTHDF3過表達細胞中YAP-220aa的表達顯著增加，但這種作用在刪除活性YTH結構域后消失（圖4D）。RIP和RNA pull-down實驗結果揭示了circ-YAP和YTHDF3之間的相互作用（圖4E，F）。此外，體外合成circ-YAP并與GST-tag YTHDF3蛋白孵育，結果顯示circ-YAP直接結合YTHDF3（圖4G）。考慮到YTHDF3介導的翻譯調節需要非經典eIF4G2，研究者進行了Co-IP實驗，并證實YTHDF3和eIF4G2在SW620和LoVo細胞中形成內源性復合體（圖4H）。正如預期，沉默eIF4G2顯著降低了YAP-220aa蛋白水平（圖4I）。RNA pull-down實驗結果表明，eIF4G2和eIF4A/B被circ-YAP富集，而這些相互作用被YTHDF3敲除消除（圖4J，K），表明circ-YAP通過YTHDF3招募eIF4G2翻譯起始復合物。功能上，敲除YTHDF3或沉默eIF4G2后，circ-YAP引起的細胞侵襲增強被明顯抵消（圖4L，M）。

圖4 YTHDF3招募eIF4G2復合體來驅動circ-YAP翻譯

5. YAP-220aa與LATS1相互作用并增加YAP的核轉位

         通過分析YAP-220aa蛋白序列，研究者發現YAP-220aa包含了YAP的WW1/2結構域，這是與LATS1相互作用所必需的，隨后YAP被14-3-3磷酸化并被保留在細胞質中。因此，研究者推測YAP-220aa可能與LATS1競爭性結合，從而阻斷YAP磷酸化。正如預期的那樣，在轉染p-circ-YAP-Flag載體的HEK293T細胞中，Flag-tag抗體大量免疫沉淀LATS1，然而，當WW1/2結構域被刪除后，上述現象消失（圖5A）。此外，在LoVo和SW620細胞中發現了YAP-220aa和LATS1之間的內源性結合（圖5B，C）。敲低circ-YAP顯著增加了YAP和LATS1, 14-3-3之間的相互作用（圖5D，E）。此外，在circ-YAP沉默的CRC細胞中，YAP-220aa減少，而YAP磷酸化增加，然而，這些作用被野生型circ-YAP過表達消除，但沒有被m6A突變的circ-YAP過表達消除（圖5F，G）。增強circ-YAP的表達導致更多的YAP從細胞質進入細胞核，m6A突變后這種現象消失（圖5H，I）。在circ-YAP沉默的CRC細胞中，YAP熒光素酶報告活性及其下游促轉移基因水平顯著降低（圖5J，K）。YAP敲低或使用YAP的藥物抑制劑維替泊芬治療后，circ-YAP誘導的侵襲和肝轉移結節被顯著消除（圖5L-N）。總之，這些數據表明，circ-YAP編碼的YAP-220aa通過與LATS1相互作用激活YAP從而促進CRC的侵襲性和肝轉移。

圖5 YAP-220aa增加YAP活性

6. YAP/TEAD復合體反轉錄激活circ-YAP

         YAP是一種轉錄共激活因子，通過與一些轉錄因子結合來調節基因轉錄。有趣的是，YAP敲低或維替泊芬處理顯著降低了HEK293T和CRC細胞中的circ-YAP表達（圖6A）。值得注意的是，新生的circ-YAP也受到YAP和維替泊芬的影響（圖6B），這表明YAP在轉錄水平調節circ-YAP表達。越來越多的證據表明，一些circRNA具有獨立于其線性親本的自身啟動子。將circYAP的啟動子片段插入pGL3-basic載體中，熒光素酶結果顯示YAP在circ-YAP起始位點上游-974~-374處增加了circ-YAP的轉錄活性（圖6C）。通過JASPAR工具進行序列分析，在上述區域發現了兩個TEAD結合基序（TB1，-886~-877，TAAATACTAT；TB2，-406~-397，CATATTCTTT）（圖6D）。如圖6E、F所示，TB1或TB2的突變顯著降低了circ-YAP的啟動子活性，但當同時突變時，YAP-5SA引起的啟動子活性增強被完全抵消。此外，YAP-5SA增加了TEAD2沉默細胞中circ-YAP的表達，但并未增加TEAD1/3/4沉默細胞中circ-YAP的表達（圖6G，H），表明TEAD1/3/4負責yap介導的circ-YAP調控。此外，ChIP檢測的結果表明，YAP與TB1和TB2結合（圖6I），同時募集Pol II和隨后的磷酸化（圖6J，K），這是從起始復合物釋放Pol II和起始延伸所需的修飾。此外，ChIP-re-ChIP數據表明，YAP/TEAD1復合物在circ-YAP啟動子的TB1和TB2處富集（圖6L，M），這也通過使用生物素標記的探針進行的DNA下拉實驗進行了驗證（圖6N）。以上結果表明，circ-YAP被YAP轉錄激活，從而形成促進結直腸癌肝轉移的正反饋環路。

圖6 Circ-YAP是YAP激活的轉錄

7. circ-YAP/YAP-220aa/YAP調控軸的臨床驗證

         最后，研究者檢測了YAP靶基因在結直腸癌組織中的表達。qRT-PCR結果顯示，circ-YAP表達與促轉移基因CYR61、CTGF、TWIST1和FOXM1呈正相關（圖7A-D）。此外，免疫染色結果顯示，92.5%的CRC病例具有相同的circ-YAP和YAP-220aa的表達趨勢，只有7.5%的病例具有不一致的表達趨勢（圖7E，F）。并且高circ-YAP與YAP的核聚集呈強正相關（圖7E，G）。YAP-220aa在有肝轉移的CRC中表達高于無肝轉移的CRC（圖7H），其AUC值為0.8597（圖7I），提示YAP-220aa可能作為預測CRC肝轉移的指標。重要的是，高circ-YAP和yap-220aa的患者比低circ-YAP和yap-220aa的患者生存時間更短（圖7J），表明兩者聯合比單獨circ-YAP具有更好的預后價值。

圖7 circ-YAP/YAP-220aa/YAP調控軸在臨床樣本中的驗證

結論：

         綜上所述，該研究揭示了circRNA編碼的蛋白和Hippo/YAP信號通路之間迄今未被識別的偶聯，對CRC肝轉移的治療具有指導意義。

實驗方法：

         定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR），熒光原位雜交（FISH），原位雜交（ISH），免疫組織化學（IHC），細胞轉染，傷口愈合實驗，Transwell實驗，CCK-8檢測，小鼠結直腸癌肝轉移模型的建立，蛋白質印跡，免疫共沉淀（Co-IP），免疫熒光（IF），RNA免疫沉淀（RIP），甲基化免疫沉淀（meRIP），RNA pull-down檢測，熒光素酶報告基因檢測，染色質免疫沉淀（ChIP），DNA pull-down檢測

參考文獻：

         Zeng K, Peng J, Xing Y, Zhang L, Zeng P, Li W, Zhang W, Pan Z, Zhou C, Lin J. A positive feedback circuit driven by m6A-modified circular RNA facilitates colorectal cancer liver metastasis. Mol Cancer. 2023 Dec 13;22(1):202. doi: 10.1186/s12943-023-01848-1.