探討L -精氨酸代謝對關(guān)節(jié)炎和炎癥性骨質(zhì)流失的影響。將L-精氨酸應(yīng)用于3種關(guān)節(jié)炎模型(膠原性關(guān)節(jié)炎、血清性關(guān)節(jié)炎和人TNF轉(zhuǎn)基因小鼠)。臨床和組織學(xué)評估炎癥，并用μCT和組織形態(tài)計量學(xué)定量觀察骨變化。體外采用RNA-seq和質(zhì)譜法分析L-精氨酸對破骨細胞分化的影響。Seahorse，單細胞能量代謝譜分析翻譯抑制和透射電鏡檢測破骨細胞的代謝變化。此外，在類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)和RA前期患者血清中測量精氨酸相關(guān)代謝物。L-精氨酸抑制三種模型的關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)流失，并直接阻斷TNFα誘導(dǎo)的小鼠和人破骨細胞生成。RNA-seq和質(zhì)譜分析表明，L-精氨酸在炎性破骨細胞中將糖酵解轉(zhuǎn)換為氧化磷酸化，導(dǎo)致ATP生成增加，嘌呤代謝增加，肌苷和次黃嘌呤水平升高。腺苷脫氨酶抑制劑阻斷肌苷和次黃嘌呤的產(chǎn)生，可消除L-精氨酸對破骨細胞發(fā)生的抑制作用。在RA和RA前期患者中也發(fā)現(xiàn)了精氨酸水平的改變。L-精氨酸通過對破骨細胞嘌呤代謝的重編程和擾動改善關(guān)節(jié)炎和骨侵蝕。該文于2023年12月發(fā)表于《Annals of Rheumatic Diseases》, IF=27.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、L-精氨酸抑制關(guān)節(jié)炎和炎癥性骨質(zhì)流失

         為了研究L-精氨酸是否可以預(yù)防炎癥和全身性炎癥性骨質(zhì)流失，作者使用血清性關(guān)節(jié)炎(SIA)模型，并在血清注射后第0天或第4天口服L-精氨酸(圖1A)。L-精氨酸可顯著減少臨床關(guān)節(jié)炎(圖1B)。滑膜炎、骨侵蝕和破骨細胞數(shù)量減少，伴有關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)Ctsk和Mmp9表達減少。作者還分析了SIA小鼠的脛骨，并沒有發(fā)現(xiàn)L-精氨酸和載藥處理之間骨量的顯著差異(圖1C、D)。盡管如此，L-精氨酸減少了脛骨破骨細胞的數(shù)量和大小(圖1E,F)，而沒有改變RANKL/OPG比率。作者假設(shè)長期的L-精氨酸治療可能會有更好的結(jié)果。因此，作者在首次免疫后第23天開始用L-精氨酸治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的DBA/1J小鼠(圖1G)。與SIA模型一樣，L-精氨酸顯著改善了關(guān)節(jié)炎癥，如關(guān)節(jié)炎評分降低所示(圖1H)。盡管關(guān)節(jié)中Ctsk和Mmp9的表達沒有差異，但L-精氨酸也減少了滑膜炎、骨侵蝕和破骨細胞的數(shù)量。脛骨和椎體骨的CT分析顯示，L-精氨酸處理改善了骨丟失，骨體積和骨小梁數(shù)量顯著增加(圖1I,J)。使用TRAP染色的破骨細胞組織形態(tài)學(xué)分析顯示，L-精氨酸處理的CIA小鼠的破骨細胞數(shù)量顯著抑制(圖1K,L)。有趣的是，骨髓上清中TNFα的表達和RANKL/ OPG比值沒有改變，這表明盡管存在促炎和促破骨細胞因子如TNFα和RANKL，但L-精氨酸可能改善骨質(zhì)流失。最后，L-精氨酸對關(guān)節(jié)炎的有益作用也在hTNFtg小鼠中得到證實，hTNFtg小鼠代表了炎癥性關(guān)節(jié)炎的自發(fā)模型。出生6周后，在飲用水中補充L-精氨酸(圖1M)。與其他兩種實驗?zāi)Ｐ鸵粯樱?span>L-精氨酸處理小鼠關(guān)節(jié)腫脹減輕，同時握力提高(圖1N,O)，炎癥面積減少。此外，CT和TRAP染色結(jié)果顯示，L-精氨酸減輕了脛骨和椎體骨破壞，骨體積增加，破骨細胞數(shù)量減少。總之，L-精氨酸通過減少破骨細胞數(shù)量來抑制關(guān)節(jié)炎和炎癥性骨質(zhì)流失。

圖1、L-精氨酸對三種小鼠關(guān)節(jié)炎模型的骨質(zhì)流失有保護作用

2、L-精氨酸減輕TNF-α誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生

         為了確定L-精氨酸是否直接作用于破骨細胞，作者分離了hTNFtg+/?和同卵對照小鼠的骨髓細胞，并進行了有或沒有L-精氨酸的MCSF/ RANKL介導(dǎo)的破骨細胞分化實驗。0.5-10mM的L-精氨酸不影響細胞活力。在WT和hTNFtg+/?細胞中，L-精氨酸以劑量依賴性的方式顯著抑制破骨細胞的發(fā)生。在WT和hTNFtg+/?細胞中，L-精氨酸也降低骨吸收活性。L-精氨酸對破骨細胞分化的抑制作用進一步證實了幾個破骨細胞特異性基因，如Traf6、Acp5、Nfatc1、Ctsk和Atp6v0d2的低表達，特別是在hTNFtg+/?小鼠分離的細胞中。接下來，作者用TNFα刺激WT骨髓細胞進行破骨細胞分化實驗，以模擬促炎微環(huán)境。在整個分化過程中或僅在分化后期補充L-精氨酸(圖2A)。使用的L-精氨酸濃度沒有任何毒性作用(圖2B)。正如預(yù)期的那樣，TNFα刺激(40ng/mL)增強了破骨細胞的數(shù)量，而10mM L-精氨酸則大大減少了破骨細胞的分化(圖2C,D)。有趣的是，在分化后期補充L-精氨酸比在整個分化過程中補充L-精氨酸更有效地抑制破骨細胞的發(fā)生(圖2C,D)。TNFα刺激促進破骨細胞中F-肌動蛋白環(huán)的形成，該環(huán)被L-精氨酸破壞(圖2E)。在TNFα刺激的細胞中，L-精氨酸也降低了骨吸收活性(圖2F,G)。破骨細胞相關(guān)基因的動力學(xué)分析說明了它們在分化過程中的變化。TNF-α刺激后，它們的表達增加，而L-精氨酸處理后，它們的表達明顯減少(圖2H)。此外，為了探討L-精氨酸在病理性破骨細胞發(fā)生中的作用，作者從C57BL/6小鼠的膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)中分離出帶有CD45+Cx3cr1+標記物的滑膜炎性巨噬細胞。然后，作者用這些細胞進行破骨細胞分化實驗，并添加L-精氨酸，有或沒有TNFα刺激。作者觀察到TNFα刺激可以顯著提高破骨細胞的分化，而L-精氨酸再次降低破骨細胞的形成。接下來，作者檢查了在完全缺乏精氨酸的情況下，在有或沒有TNFα刺激的情況下，破骨細胞生成是否受損。正如預(yù)期的那樣，在不含L-精氨酸的培養(yǎng)基中，破骨細胞的發(fā)生完全被抑制。為了描述L-精氨酸對破骨細胞分化最重要的下游代謝物，特別是在TNFα刺激后，作者向細胞補充腐胺、鳥氨酸或亞精胺，這些代謝物在存在或不存在TNFα的情況下由精氨酸酶催化直接產(chǎn)生。有趣的是，腐胺可以顯著減少破骨細胞的分化，抑制OC相關(guān)基因的表達，尤其是在TNFα刺激后。高濃度鳥氨酸(25mM)也可以僅在TNFα刺激下減少破骨細胞的生成，而亞精胺不改變破骨細胞的數(shù)量。總的來說，L-精氨酸在體外抑制破骨細胞分化，特別是在炎癥條件下。

圖2、L-精氨酸降低TNF-α誘導(dǎo)的破骨細胞生成和再吸收活性

3、L-精氨酸促進氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生

         為了描述L-精氨酸的功能，研究人員對經(jīng)L-精氨酸處理的破骨細胞進行了RNA測序，這些破骨細胞分別受到TNFα刺激或未受到刺激。在未受刺激的細胞中，只有少數(shù)基因和相關(guān)通路在經(jīng)L-精氨酸處理的細胞中富集(圖2I)。然而，當細胞受到TNF -α刺激時，KEGG通路分析顯示，L-精氨酸后氧化磷酸化通路基因強烈富集(圖2J)。GSEA進一步證明，與TNFα刺激的細胞相比，TNFα/ L-精氨酸處理的細胞中氧化磷酸化顯著富集(圖2K)。熱圖分析還突出了與氧化磷酸化相關(guān)的基因，這些基因在TNFα/ L-精氨酸處理的細胞中顯著上調(diào)(圖2L)。為了進一步證實TNFα/ L-精氨酸處理的細胞中氧化磷酸化的增強，進行了細胞外通量測定。糖酵解在WT和hTNFtg+/?前破骨細胞中沒有改變。與WT細胞相比，hTNFtg+/?細胞的氧化磷酸化水平較低，但被L-精氨酸拯救。此外，L-精氨酸后最大呼吸、非線粒體耗氧量、ATP生成和質(zhì)子泄漏增加。在RNA水平上，加入L-精氨酸后，參與氧化磷酸化的基因表達增加。同樣，TNFα刺激促進WT細胞的糖酵解，而L-精氨酸不影響糖酵解(圖3A)。同時，TNFα抑制氧化磷酸化，促進ATP的產(chǎn)生，而L-精氨酸(10mM)逆轉(zhuǎn)了這一作用(圖3B,C)。糖酵解產(chǎn)生的ATP增加，而氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP減少，分化為破骨細胞。TNFα刺激后，糖酵解ATP產(chǎn)量增加，但被L-精氨酸轉(zhuǎn)換為氧化磷酸化(圖3D,E)。為了研究單細胞水平的能量代謝，作者對從四個治療組分離的破骨前細胞進行了SCENITH實驗。精氨酸增加了TNF α刺激細胞的線粒體依賴性，降低了糖酵解能力(圖3F、G)。葡萄糖依賴性或脂肪酸和氨基酸氧化能力沒有差異。此外，L-精氨酸氧化磷酸化的增加與葡萄糖消耗的增加無關(guān)(圖3H)。L-精氨酸處理后，線粒體ROS水平略有下降。當通過透射電鏡分析線粒體形態(tài)時，四種刺激之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。因此，作者探討了線粒體膜電位可能的變化。JC-1染色顯示TNFα刺激后線粒體膜電位受損，而L-精氨酸恢復(fù)了膜電位(圖3I,J)。最后，當魚藤酮和抗霉素阻斷氧化磷酸化時，L-精氨酸的作用僅在TNF α刺激的條件下以劑量依賴的方式被消除(圖3K-N)。

圖3、l -精氨酸促進炎癥條件下破骨細胞氧化磷酸化(OXPHOS)和ATP的產(chǎn)生

4、精氨酸酶-1的誘導(dǎo)介導(dǎo)L-精氨酸對破骨細胞的抑制作用

         為了研究作者模型中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者基于作者的RNA測序數(shù)據(jù)進行了轉(zhuǎn)錄因子富集分析。有趣的是，從DEGs中發(fā)現(xiàn)c-Jun在所有三個轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中都富集(圖4A)。由于c-Jun是一種已知的控制破骨細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，其表達與巨噬細胞中精氨酸酶-1 (Arg-1)的表達呈負相關(guān)，因此作者在四種培養(yǎng)條件下對c-Jun進行了蛋白水平的表征。TNFα增強了C-Jun的表達，但L-精氨酸后C-Jun的表達明顯降低，尤其是在破骨細胞分化后期補充L-精氨酸時(圖4B)。接下來，作者分析了c-Jun在有或沒有TNFα刺激的破骨細胞發(fā)生中的作用。為此，作者從cJunΔLysM和同窩對照小鼠中分離骨髓細胞。即使在TNFα刺激后，c-Jun缺陷細胞的破骨細胞數(shù)量也較低(圖4C,D)。有趣的是，TNFα刺激后，c-Jun缺陷破骨細胞中Arg1的表達顯著升高，而Arg2的表達不變(圖4E)。因此，作者研究了Arg-1在L-精氨酸介導(dǎo)的破骨細胞抑制中的作用。CIA使L-精氨酸處理小鼠足部組織溶物精氨酸酶活性升高，尿素水平不變，亞硝酸鹽水平降低(圖4F)。這些數(shù)據(jù)提示c-Jun調(diào)控Arg1的表達，介導(dǎo)L-精氨酸對破骨細胞分化的抑制作用。為了驗證c-Jun是否在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Arg1的表達，特別是在TNF -α刺激下，作者在Arg1轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游5000bp處加入了c-Jun，并用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測了Arg1啟動子上8個可能的c-Jun結(jié)合位點(圖4G)。然后在TNFα刺激的破骨前細胞中使用抗c- jun抗體進行ChIP-qPCR。事實上，c-Jun在穩(wěn)定狀態(tài)下可以結(jié)合啟動子位點3、4、5和8，在TNFα刺激下可以結(jié)合啟動子位點1、2、4、6和8(圖4G)。有趣的是，染色質(zhì)重塑標記顯示c-Jun結(jié)合位點的抑制模式，TNFα刺激后Arg1啟動子的H3me3K27甲基化增強，而H3me3K4甲基化未檢測到變化(圖4H)。這些結(jié)果表明TNFα通過c-Jun下調(diào)Arg1的表達。接下來，作者分析了來自兩株Arg-1條件敲除小鼠的骨髓來源的破骨細胞。正如預(yù)期的那樣，在TNFα刺激后，L-精氨酸可以減少WT細胞的破骨細胞分化，但在Arg-1缺陷細胞中則沒有(圖4I-L)。綜上所述，這些結(jié)果表明Arg-1對于L-精氨酸抑制TNFα刺激后的破骨細胞生成至關(guān)重要。

圖4、精氨酸酶-1的誘導(dǎo)介導(dǎo)了L-精氨酸對破骨細胞的抑制作用

5、L-精氨酸對炎癥刺激的嘌呤代謝進行了重新編程

         為了研究補充L-精氨酸后的代謝通量，作者首先使用13c同位素標記對L-精氨酸進行了代謝追蹤。如圖5A所示，補充13C6 -L-精氨酸后用13c同位素標記的下游代謝物為鳥氨酸、精胺、n -乙酰-亞精胺、n -乙酰-瓜氨酸/瓜氨酸、d-脯氨酸、吡啉和吡羅烷。有趣的是，從個體代謝物的同位素分布圖中可以看出，TNFα刺激增加了13C6 - L-精氨酸的消耗，而補充13C6 - L-精氨酸則增加了其細胞濃度。此外，補充13C6 - l-精氨酸可促進13C4 -鳥氨酸、13C5 - d -脯氨酸、13C4 -精胺、13C4 - n -乙酰亞精胺、13C4 -吡咯啉和13C4 -吡咯烷的生成。然而，補充13C6 - L-精氨酸減少了TNF - α刺激下13C5 -鳥氨酸的產(chǎn)生，這意味著只在炎癥條件下增加了鳥氨酸的消耗。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，升高的L-精氨酸生物利用度確實使代謝通量向Arg-1方向傾斜。接下來，為了進一步研究L-精氨酸處理對細胞內(nèi)代謝的影響并闡明下游代謝途徑，作者對受或不受L-精氨酸和TNFα刺激的破骨細胞進行了非靶向代謝組學(xué)分析。正如預(yù)期的那樣，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的途徑富集證實了L-精氨酸處理的破骨細胞中精氨酸和脯氨酸代謝的增加(圖5B)。最有趣的是，與TNFα刺激的細胞相比，TNFα+ L-精氨酸處理的細胞中嘌呤代謝豐富(圖5B)。次黃嘌呤和肌苷的產(chǎn)生增加，可能是由于ATP的產(chǎn)生增加(圖5C,D)。TNFα+精氨酸處理的細胞腺苷和腺嘌呤產(chǎn)量顯著降低。與代謝組學(xué)結(jié)果一致，RNA-seq數(shù)據(jù)也表明，在TNFα+ L-精氨酸處理的細胞中，嘌呤代謝相關(guān)途徑在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中顯著豐富(圖5E)。與嘌呤代謝相關(guān)的編碼酶基因也發(fā)生了相應(yīng)的變化(圖5F)。特別是，腺苷脫氨酶(ADA)和Nt5c1a在L-精氨酸處理TNF α刺激的細胞時特異性上調(diào)(圖5F)。在有或沒有TNF - α刺激的情況下，對腐胺、鳥氨酸或亞精胺處理下嘌呤代謝酶編碼基因進行分析。TNFα刺激可促進Ampd、Nt5cla、Pnp、Hprt和Xdh的表達，腐胺抑制其表達。然而，盡管低濃度(5μm)亞精胺對破骨細胞生成沒有影響，但在TNFα刺激后，亞精胺增強了Ampd、Nt5cla、Ada、Pnp和Xdh的表達。鳥氨酸也增強了TNFα刺激后Ampd和Ada的表達。總的來說，這些結(jié)果表明L-精氨酸在炎癥刺激下重編程嘌呤代謝。為了進一步分析嘌呤代謝在破骨細胞形成中的作用，作者誘導(dǎo)破骨細胞分化，并分別用肌苷和次黃嘌呤處理細胞。肌苷和次黃嘌呤均能抑制體外破骨細胞生成，尤其是TNF -α刺激后(圖6A,B)。通過使用ADA抑制劑(戊他汀或紅-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)阻止肌苷和次黃嘌呤的產(chǎn)生，作者可以逆轉(zhuǎn)L-精氨酸對炎癥環(huán)境中破骨細胞分化的抑制作用(圖6C-E)。接下來，作者分析了補充L-精氨酸的CIA小鼠體內(nèi)ADA抑制效果(圖6F)。如前所述，L-精氨酸可顯著改善關(guān)節(jié)炎，而噴妥他汀可完全恢復(fù)關(guān)節(jié)炎(圖6G)。脛骨組織形態(tài)學(xué)分析表明，補充L-精氨酸可減少破骨細胞，防止炎癥性骨質(zhì)流失。然而，ADA抑制逆轉(zhuǎn)了L-精氨酸的作用(圖6H, I)。綜上所述，L-精氨酸誘導(dǎo)的嘌呤代謝介導(dǎo)了體外和體內(nèi)炎癥性破骨細胞發(fā)生的抑制。

圖5、L-精氨酸干擾TNFα刺激細胞的嘌呤代謝。

圖6、L-精氨酸通過控制腺苷脫氨酶減輕炎癥性骨質(zhì)流失

6、RA患者精氨酸水平的改變和L-精氨酸對人破骨細胞生成的抑制作用

         為了研究RA患者的精氨酸水平是否發(fā)生變化，作者采用UPLC-MS (UPLC-MS)分析了23名RA患者和29名年齡匹配和性別匹配的健康對照者的血清樣本，以確定參與尿素循環(huán)的氨基酸水平。與健康對照相比，RA患者血清精氨酸水平顯著升高，鳥氨酸水平降低，瓜氨酸和脯氨酸水平不變(圖7A)。此外，在輕度至中度疾病活動度(DAS28評分<5.2單位)的RA患者中，精氨酸水平與疾病嚴重程度顯著相關(guān)(圖7B)。作者還在另一組RA前期患者中測試了這些氨基酸水平。有趣的是，在隨后發(fā)展為關(guān)節(jié)炎的RA前期患者(有風險的進展者)中，與健康對照相比，d-精氨酸水平提高，而鳥氨酸和d -脯氨酸顯著降低，瓜氨酸水平保持不變(圖7C)。總的來說，在RA和RA前期患者中，精氨酸表達顯著升高，這意味著即使在疾病的早期階段，精氨酸代謝也存在失調(diào)。最后，作者還研究了L-精氨酸在人細胞破骨細胞中的作用。外周血單個核細胞(PBMC)衍生的破骨細胞用10mM L-精氨酸處理，用20pg/mL TNFα刺激(圖7D)。L-精氨酸處理后，無論是在MCSF和RANKL刺激的細胞中，還是在TNFα額外刺激的細胞中，都觀察到破骨細胞數(shù)量和破骨細胞標志物表達的顯著減少(圖7E-G)。因此，L-精氨酸也抑制人類破骨細胞的發(fā)生。

圖7、類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者精氨酸代謝的改變和L-精氨酸抑制人類破骨細胞生成

結(jié)論

         總之，作者的觀察表明，L-精氨酸通過重編程破骨細胞的氨基酸代謝來抑制關(guān)節(jié)炎、炎癥性破骨細胞生成和炎癥性骨質(zhì)流失。因此，治療性補充L-精氨酸可能是一種抑制關(guān)節(jié)炎炎癥和防止炎癥性骨質(zhì)流失的飲食策略。

實驗方法

         RNA測序、代謝組學(xué)、質(zhì)譜分析、Seahorse平臺進行細胞外通量測定

參考文獻

         Cao S, Li Y, Song R, Meng X, Fuchs M, Liang C, Kachler K, Meng X, Wen J, Schl?tzer-Schrehardt U, Taudte V, Gessner A, Kunz M, Schleicher U, Zaiss MM, Kastbom A, Chen X, Schett G, Bozec A. L-arginine metabolism inhibits arthritis and inflammatory bone loss. Ann Rheum Dis. 2023 Dec 8:ard-2022-223626. doi: 10.1136/ard-2022-223626. Epub ahead of print. PMID: 37775153.