胰腺癌（PCa）是最致命的人類惡性腫瘤之一。間質組織向PCa腫瘤微環境浸潤的增強限制了惡性上皮細胞中關鍵腫瘤特異性轉錄因子和表觀基因組異常的鑒定。對胰腺癌類器官的整合轉錄組和表觀遺傳多組學分析表明，堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子40（BHLHE40）在腫瘤樣本中顯著上調。BHLHE40不僅作為經典轉錄因子調節固醇調節元件結合因子1（SREBF1）的轉錄，而且連接SREBF1的增強子和啟動子區域。BHLHE40-SREBF1-硬脂酰輔酶A去飽和酶軸保護PCa細胞免受鐵死亡，導致脂質過氧化的積累減少。此外，SREBF1抑制劑fatostatin顯著抑制BHLHE40高表達的PCa腫瘤的生長。該研究于2023年12月發表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術路線：

主要研究結果：

1. 胰腺癌患者來源的類器官中BHLHE40位點的開放染色質

        使用ATAC-seq和CUT&Tag H3K27ac修飾譜分析兩對腫瘤（PTO1和PTO2）和癌旁（PNO1和PNO2）組織類器官（圖1A）。通過評估TCGA中PAAD數據集的mRNA-seq中差異表達轉錄因子組的基因的交集，以及PCa類器官中增強的結合位點的H3K27ac CUT&Tag分析和上調的可及性增強區域的ATAC-seq分析確定了一個轉錄因子（BHLHE40），用于進一步研究（圖1A）。與PNOs相比，在PCa類器官中，H3K27ac富集于BHLHE40的啟動子區域（圖1B）。EP300沉默或抑制（使用C646作為抑制劑）持續降低PANC-1和BxPC-3細胞系中BHLHE40的H3K27ac表達水平（圖1C）。因此得出結論，EP300介導的H3K27ac修飾參與BHLHE40的上調。由于BHLHE40在肝細胞中的誘導被mTOR信號的抑制劑雷帕霉素所阻止，隨后研究了mTOR信號對BHLHE40的影響BHLHE40的表達。BHLHE40表達越高的臨床樣本或PCa細胞雷帕霉素IC50值越低，表明這些樣本更容易受到雷帕霉素的影響（圖1D）。雷帕霉素降低PANC-1和BxPC-3細胞中BHLHE40的表達水平（圖1E）。先前的研究表明mTOR激活EP300誘導脂肪生成為證實mTOR-EP300對BHLHE40表達的調控作用，作者進一步證明雷帕霉素處理顯著降低PANC-1和BxPC3細胞中EP300的活化（圖1F）。PCa臨床樣本的IHC染色結果顯示，BHLHE40在腫瘤樣本中的表達水平高于癌旁組織（圖1G,H）。在GEO（GSE16515）和TCGA-PAAD數據集中觀察到RNA水平的類似結果（圖1I）。在PCa患者中，較高的BHLHE40表達與總生存期降低顯著相關（圖1J）。綜上所述，啟動子區染色質可及性的增加和mTOR通路活性的增強導致BHLHE40在PCa中表達的升高，而BHLHE40在PCa中呈不良預后。

圖1. 胰腺導管腺癌中BHLHE40及其上游調控因子的鑒定

2. BHLHE40基因下調可減少腫瘤發生和胰腺癌的轉移

        在兩個高表達的細胞系（PANC-1和BxPC-3）中沉默BHLHE40，并在MIA PaCa-2細胞中過表達BHLHE40。利用蛋白質印跡法（western blot）評估BHLHE40的敲低和過表達（圖2A）。BHLHE40敲低降低細胞增殖（圖2B）和遷移（圖2C）。皮下移植瘤實驗表明，BHLHE40沉默細胞誘導的腫瘤顯著小于對照誘導的腫瘤（圖2D-E）。免疫組織化學染色顯示，BHLHE40敲低組中Ki-67豐度降低（圖2F）。此外，PET/CT發光信號顯示，BHLHE40沉默部分抑制PCa細胞在肝臟中的轉移能力（圖2G,H）。BHLHE40過表達增強了PCa細胞的體外和體內致瘤性（圖2I-K）。同樣，在兩個已建立的PCa類器官（PTO1和PTO2）中，BHLHE40敲低降低細胞增殖（圖2L-N）。因此，這些數據表明BHLHE40具有很強的致癌功能。

圖2. BHLHE40在體內外均可促進胰腺癌的增殖和肝轉移

3. BHLHE40通過SREBF1調節胰腺癌脂肪酸代謝關鍵因子

        對BHLHE40沉默的PCa細胞系進行轉錄組分析（圖3A）。DEGs富集在脂肪酸代謝的生物過程中（圖3B）。BHLHE40的ChIP-seq表明，BHLHE40主要與啟動子和基因間區結合，提示其可能在靶基因的轉錄調控中發揮多重作用（圖3C）。共篩選出187個基因作為RNA-seq和BHLHE40 ChIP-seq數據集的交集組。其中，SREBF1引起興趣（圖3A），因為它調節參與脂肪酸合成的關鍵因子，并且在幾種癌癥類型中過表達BHLHE40。ChIP-seq（圖3D）和熒光素酶報告基因檢測（圖3E）的結果表明，BHLHE40與SREBF1的啟動子區域結合。此外，對H3K4me3進行了ChIP-qPCR，以確認SREBF1啟動子的激活（圖3F）。

        與其他癌癥類型相似，PCa表現出SREBF1的上調（圖3G）。較高的SREBF1表達與總生存期降低相關（圖3H）。正如預期的那樣，沉默BHLHE40降低PCa細胞和類器官中SREBF1及其下游靶點的表達（圖3I-J）。免疫熒光（IF）檢測表明，在來自PTO1細胞的惡性導管細胞中，BHLHE40與SREBF1共定位（圖3K）。綜上所述，BHLHE40調控SREBF1的轉錄，而SREBF1是PCa中脂肪酸代謝的關鍵因子。

圖3. BHLHE40過表達通過改變胰腺癌細胞的致癌轉錄組促進腫瘤的發生

4. 相分離的BHLHE40凝聚物有助于SREBF1基因座的增強子和啟動子區域的連接

        在鱗狀細胞癌細胞中，SREBF1基因座的側翼有增強子或超級增強子對PANC-1細胞Hi-C測序數據的分析顯示，SREBF1啟動子和潛在增強子區域之間存在一個染色體內環;然而，這一環在永生化的正常胰腺上皮細胞系（HPNE）中并不明顯（圖4A）。沉默BHLHE40降低染色質的開放程度，特別是在BHLHE40結合的SREBF1的啟動子和增強子區域（圖4A）。在PANC-1細胞中，通過3C檢測證實SREBF1增強子和啟動子區域之間存在染色體內環。值得注意的是，該環在BHLHE40沉默后未檢測到（圖4B），提示其由BHLHE40介導。此外，BHLHE40沉默降低基因組水平的H3K27ac修飾，尤其是SREBF1基因座上游的H3K27ac修飾，從而進一步證實BHLHE40對SREBF1轉錄的調控（圖4C）。然而，根據超級增強子排序（Rank order of super - enhancer, ROSE）算法預測，SREBF1位點上游假定的增強子的17 kb片段被移除（圖4C），因此SREBF1蛋白水平降低，但BHLHE40過表達不能完全恢復（圖4D）。

        免疫共沉淀（Co-IP）證實BHLHE40與BRD4、MED1和Pol II的相互作用（圖4E）。ChIP-qPCR還表明，這些共激活因子以bhlhe40依賴的方式與SREBF1的啟動子和增強子區結合（圖4F）。BHLHE40連接啟動子和增強子區域，在SREBF1基因座上游形成一個染色體內環。

        自然紊亂區域（PONDRs）評分預測因子顯示BHLHE40含有大IDR（177 ~ 319個氨基酸的片段）（圖5A）。純化重組mEGFP、mEGFP-BHLHE40（全長，FL）、mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）和刪除177-319aa的mEGFP-BHLHE40[稱為BHLHE40 （Δ177-319aa）]蛋白。mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）以濃度依賴性方式形成球形液滴（圖5B）。mEGFP-BHLHE40或mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）形成的液滴逐漸融合，形成更大更亮的液滴（圖5C）。使用2D培養的PTO1和PTO2細胞，可以觀察到BHLHE40在細胞核內的點狀分布（圖5D）。通過測定光漂白后的熒光回收率（FRAP）來測定mEGFP-BHLHE40形成的類液態凝聚物的動態重組和快速交換動力學。光漂白后，mEGFP-BHLHE40點狀體在數秒內恢復熒光（圖5E-G）。3C檢測結果顯示，全長BHLHE40可以促進染色體內環的形成，而BHLHE40 （Δ177- 319aa）則不能（圖4B）。這些結果表明相分離的BHLHE40凝集物促進SREBF1位點增強子和啟動子區域的連接，從而促進SREBF1的轉錄。

圖4. BHLHE40促進SREBF1基因座上游增強子和啟動子區域的連接

圖5. BHLHE40在體內外均可形成相分離凝聚體

5. BHLHE40誘導的SREBF1上調通過SCD1保護PCa細胞免于鐵死亡

        由于BHLHE40和SREBF1導致PCa中脂肪酸代謝的失調（圖3B,C），因此研究BHLHE40通過SREBF1在過氧化作用中的作用。使用BODIPY 581/591 C11探針檢測氧化脂質的流式細胞術表明，BHLHE40敲低增加脂質過氧化作用（圖6A）。在BHLHE40敲低的細胞中，MDA水平也增強（圖6B,C）。此外，BHLHE40或SREBF1敲低的細胞表現出線粒體萎縮和脂滴增加，這類似于RAS-選擇性致死蛋白-3（RSL3）誘導的鐵依賴性氧化性細胞死亡（圖6D-F）。鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（fer）至少部分消除增強的脂質過氧化作用（圖6A-C），并恢復BHLHE40敲低導致的細胞活力下降（圖6G,H）。此外，SREBF1沉默促進PCa細胞中的鐵死亡（圖6I-K）。

        為研究BHLHE40抑制鐵死亡是否需要SREBF1，在BHLHE40敲低的PCa細胞中過表達SREBF1（圖6L）。SREBF1過表達緩解BHLHE40敲低引起的脂質過氧化（圖6M,N）。在PCa臨床樣本中BHLHE40的表達水平與SREBF1和SCD1的表達水平相關（圖6O,P）。因此，BHLHE40主要通過上調SREBF1的表達來保護PCa細胞免于鐵死亡。

圖6. 體內BHLHE40缺失可通過SREBF1促進胰腺癌的鐵死亡

6. SREBF1抑制劑（Fatostatin）在BHLHE40高表達的PCa中表現出顯著的抗腫瘤療效

        雖然SREBF1抑制劑fatostatin有抑制腫瘤生長和活性的報道，但對PCa細胞的作用尚未明確。fastostatin處理后PANC-1細胞活力明顯降低，且呈劑量依賴性;然而，fastostatin處理后MIA PaCa-2細胞的活力沒有觀察到明顯的差異，這可能是由于BHLHE40在MIA PaCa-2細胞中的低表達（圖7A）。在患者來源的類器官（圖7B、C）和KPC小鼠細胞系的體內胰腺原位模型（圖7D-H）中觀察到類似結果。此外，IHC染色顯示，與BHLHE40表達水平較低的細胞誘導的原位腫瘤相比，BHLHE40表達水平較高的KPC小鼠細胞誘導的原位腫瘤的Ki-67表達水平顯著降低（圖7I）。因此，這些數據表明，SREBF1抑制劑對PCa具有顯著的抗腫瘤作用，這依賴于BHLHE40的表達水平。

圖7. SREBF1的特異性抑制劑fatostatin在PCa中發揮抗腫瘤作用

結論

        綜上所述，本研究發現染色質開放誘導的BHLHE40表達在腫瘤中顯著上調。BHLHE40上調SREBP的詳細機制為PI3K-AKT-mTORC-SREBP信號軸提供了新的見解。此外，本研究首次揭示了BHLHE40-SREBF1-SCD1-鐵死亡軸在PCa進展中的作用，這可能為以脂肪酸合成和去飽和為靶點的PCa治療策略的開發提供線索。

實驗方法

        從胰腺癌手術樣本中生成類器官，細胞培養和轉染，細胞遷移檢測，RNA提取及mRNA-Seq文庫制備，雷帕霉素IC50評分與BHLHE40基因表達的Spearman相關性分析，使用GEPIA分析來自TCGA和基因型-組織表達（GTEx）的數據，ChIP-seq，CUT&Tag庫生成和測序，核分離和ATAC-Seq文庫制備，Hi-C分析和染色體構象捕獲實驗（3C），差異可達區域的識別，免疫沉淀和免疫印跡，RNA分離及實時熒光定量PCR，克隆形成實驗，細胞增殖和活力測定，蛋白質純化和體外相分離觀察，FRAP實驗，類器官細胞活力測定，C11-BIDOPY染色，雙熒光素酶報告基因檢測，MDA測定，透射電鏡（TEM）成像，動物研究（皮下和原位模型），細胞凋亡檢測，KPC小鼠衍生細胞系的構建

參考文獻

        Cao Y, Wang X, Liu Y, Liu P, Qin J, Zhu Y, Zhai S, Jiang Y, Liu Y, Han L, Luo J, Zhang R, Shi M, Wang L, Tang X, Xue M, Liu J, Wang W, Wen C, Deng X, Peng C, Chen H, Cheng D, Jiang L, Shen B. BHLHE40 Inhibits Ferroptosis in Pancreatic Cancer Cells via Upregulating SREBF1. Adv Sci (Weinh). 2023 Dec 8:e2306298. doi: 10.1002/advs.202306298. Epub ahead of print. PMID: 38064101.