內質網應激在結締組織疾病的分子病理中起著重要的作用。為了應對內質網應激，細胞可以上調巨噬/自噬，這是細胞降解和回收蛋白質或去除受損細胞器的基本細胞穩態過程。在這些情況下，自噬激活可以支持細胞存活。在這里，我們通過體外和體內方法證明，來自Col6a1-?-(膠原，VI型，α1)缺失小鼠的巨核細胞顯示COL6多肽的細胞內保留增加，內質網應激和凋亡。未折疊蛋白反應在col6a1-/-巨核細胞中被激活，這可以通過分子伴侶的上調、Xbp1 mRNA剪接的增加和促凋亡調節因子DDIT3/CHOP的高水平來證明。盡管內質網應激，基底自噬在col6a1-/-巨核細胞中受損，表現為BECN1水平降低和自噬體成熟度降低。饑餓和雷帕霉素治療可挽救巨核細胞的自噬通量，導致細胞內COL6多肽潴留、內質網應激和細胞凋亡減少。此外，Bethlem肌病和Ullrich先天性肌營養不良(兩種col6相關疾病)患者外周血造血祖細胞培養的巨核細胞表現出凋亡增加、內質網應激和自噬受損。這些數據表明，巨核細胞中膠原遺傳障礙、內質網應激和自噬調節可能是相互關聯的。該研究于2023年3月發表于《Autophagy》上，IF=13.3，題為“Lack of COL6/collagen VI causes megakaryocyte dysfunction by impairing autophagy and inducing apoptosis”。

技術路線

研究思路

1. Col6a1-/-Mks中的內質網應激

        作者研究了COL6合成的改變是否會影響內質網蛋白合成的穩態。RT-qPCR分析體外培養或直接從BM樣品中分選的Mks的UPR通路發現，Col6a1-/-細胞顯示編碼ATF4(激活轉錄因子4)和ATF6、PPP1R15A/GADD34(蛋白磷酸酶1，調節亞基15A)、HSPA5/Bip(熱休克蛋白5)、HSP90B1/GRP94(熱休克蛋白90，β (GRP94)，成員1)和膠原特異性伴侶SERPINH1/HSP47(絲氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制劑，分支H、成員1)，與野生型(WT)細胞相比，編碼XBP1 (X-box結合蛋白1)的轉錄本剪接增加(圖1A-C)。這些數據通過UPR關鍵調控因子的western blot分析得到證實。此外，Col6a1-/-Mks的特征是DDIT3/CHOP蛋白水平顯著升高(圖1d和E)，這是一種與PPP1R15A激活直接相關的轉錄因子，它有助于在未解決的慢性內質網應激中激活細胞死亡信號。UPR誘導導致內質網結構改變，從而增加蛋白質折疊能力。共聚焦和透射電鏡顯示，培養的Col6a1-/-Mks顯示內質網擴張，這是內質網應激的典型標志(圖1F-H)。通過直接染色Col6a1-/-BM活檢獲得的Mks證實了相同的形態畸。

圖1 Col6a1-/-Mks內質網應激

2. Col6a1-/-Mks細胞內COL6的積累

        與WT相比，在抗壞血酸存在下培養的Col6a1-/-Mks不能分泌COL6，這在培養基中或靠近細胞膜的地方是檢測不到的。此外，作者用COL6多克隆抗體共聚焦顯微鏡和COL6 α2鏈單克隆抗體western blot分析了COL6在Mks中的存在。這些實驗表明，與WT mk相比，Col6a1?/?中COL6鏈的細胞內保留率顯著增加(圖2a和B)。

圖2 Col6a1-/-Mks細胞內COL6的積累

3. Col6a1-/-Mks的基礎自噬激活缺陷

        為了深入了解自噬激活狀態，Mks被mCherry-EGFP-LC3B報告質粒轉染。這種結構可以區分自噬體(mCherry EGFP)和自噬體與溶酶體(即自噬體)融合產生的晚期自噬結構，在自噬體中，由于溶酶體依賴囊泡腔的酸化而發生EGFP破壞(mCherry EGFP+++ -)。Col6a1-/-Mks顯示自噬起始減少，LC3B點總數，WIPI2點數量和BECN1 (beclin 1，自噬相關)蛋白水平顯示(圖3A和B)。此外，Col6a1-/-Mks顯示自噬體成熟減少，mCherry EGFP + - LC3B點的數量較低，僅mCherry點的百分比較低，表明基礎自噬通量減弱(圖3A-C)。這些數據通過使用溶酶體抑制劑氯喹處理Mks得到證實，隨后進行LC3B和SQSTM1/p62周轉率的western blot分析(圖3D和E)。

圖3 Col6a1-/-Mks的基礎自噬激活不足

4. Col6a1-/-小鼠Mks和血小板凋亡增加

        為了研究UPR的誘導和基礎自噬通量的改變是否影響Mk凋亡，作者用ANXA5/annexin V和7-氨基放線菌素D (7-AAD)染色WT和Col6a1-/-Mks，測定細胞凋亡/壞死率。在體外和體內，更高比例的Col6a1-/-Mks發生凋亡(ANXA5/annexin V 7-AAD+ -)，最終導致更高比例的壞死Mks (ANXA5/annexin V 7-AAD++)(圖4A和B)。與WT相比，Col6a1-/-Mks中促凋亡蛋白BAX與抗凋亡蛋白BCL2和BCL2L1/Bcl-xL的比例增加[21]證實了這些數據(圖4C和D)。與WT相比，Col6a1-/-小鼠的外周血血小板中ANXA5/annexin V+的比例更高(圖4E和F)， BAX與BCL2和BCL2L1/Bcl-xL的比例增加(圖4)。因此，Col6a1-/-小鼠的體內血小板在外周血中被過早清除，t1/2減少了約30%(從大約1/2)。60 h至40 h)，通過跟蹤生物素標記的血小板的體內存活情揭示了這一點。為了證明Col6a1-/-小鼠中觀察到的血小板缺陷是否是血小板固有的，作者通過在Col6a1-/-小鼠中注入WT血小板和在WT小鼠中注入Col6a1-/-血小板進行了互惠過繼轉移。通過這種方法，作者發現WT和Col6a1-/-外周血血小板都保持了原來的半衰期，從而表明半衰期的減少是血小板固有的，而不依賴于環境因素。

圖4 Col6a1-/-Mks和血小板在體外和體內顯示出增加的凋亡

5.      饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks的自噬激活

        自噬受PI3K-AKT-MTOR通路調控，作者最近證實該通路在Col6缺乏的Mks中被過度激活。為了避免Col6a1-/-Mks顯示的基礎自噬誘導和自噬通量的減少，作者進行了血清饑餓和雷帕霉素治療，這是兩種已知的自噬刺激[23-25]。兩種處理都恢復了MTOR通路的激活，并同時誘導了Col6a1-/-Mks中的自噬和自噬通量，這可以通過LC3B點的總數、mCherry EGFP+ -點的數量和僅mCherry點的百分比來證明(+圖5 A-C)。在血清饑餓和雷帕霉素治療下，用氯喹阻斷溶酶體功能導致Col6a1-/-Mks中LC3B脂化相對WT進一步增加(圖5D)。這些處理也挽救了自噬底物SQSTM1/p62的積累(圖5E)，并誘導了Col6a1-/-Mks中WIPI2點的形成。

圖5 饑餓和雷帕霉素治療可挽救Col6a1-/-Mks的自噬激活

6. 饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks細胞內COL6滯留、內質網應激和細胞凋亡

        饑餓和雷帕霉素處理增加了WT和Col6a1-/-Mks中lc3b陽性自噬體和lamp2陽性溶酶體與內質網的共定位(圖6A-F)，隨后Col6a1-/-Mks中細胞內COL6潴留量恢復到WT水平，共聚焦顯微鏡顯示(圖7A和B))。western blot分析培養基中分泌的COL6表明，饑餓和雷帕霉素處理后細胞內COL6潴留的減少不是由于COL6的分泌。在bm衍生的Col6a1-/-Mks中，UPR通路在mRNA和蛋白質水平上的顯著減少與這種效應相平行(圖7C-E)。透射電鏡顯示，血清饑餓和雷帕霉素處理后，Col6a1-/-Mks未觀察到內質網形態學改變(圖7F)。為了證明饑餓和雷帕霉素治療后UPR激活的恢復是由于自噬激活，作者用自噬抑制劑氯喹治療Mks。在氯喹存在的情況下，兩種處理均未能使UPR標記物的表達正常化。血清饑餓和雷帕霉素處理對自噬誘導和內質網應激的影響也對Col6a1-/-Mks的存活有顯著影響。事實上，7-aad染色的流式細胞術分析和BAX與BCL2和BCL2L1/Bcl-xL比例的western blot分析顯示，血清饑餓或雷帕霉素處理的Col6a1-/-Mks細胞凋亡和細胞死亡顯著減少(圖7 G-J)。與未處理的對照組相比，體內雷帕霉素處理顯著降低了Col6a1-/-bm分類的Mks的內質網應激和自噬分子特征的誘導(圖7K和L)。正如作者最近發表的，體內給藥雷帕霉素也僅在Col6a1-/-小鼠中誘導循環血小板數量顯著增加，達到WT水。

圖6 在WT和Col6a1-/-Mks中，內質網與lc3b陽性自噬體和lamp2陽性溶酶體共定位

圖7 饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks細胞內COL6滯留、內質網應激和凋亡

7. Col6相關疾病患者的Mks和血小板中細胞凋亡、內質網應激和自噬缺陷增加

        作者從伯利恒肌病和UCMD患者的外周血以及健康受試者的外周血中分化出Mks。來自患者的Mks在分子和蛋白質水平上均顯示內質網應激標志物的表達增加(圖8A-C))。此外，共聚焦顯微鏡顯示患者Mks的ER明顯擴張(圖8D)。與來自健康受試者的Mks相比，來自患者的Mks在基礎條件下和使用氯喹阻斷溶酶體功能后顯示LC3B點的數量減少(圖8E)。

        最后，與健康對照者分化的Mks相比，患者分化的Mks表現出更多的凋亡和壞死(圖8F)。與健康受試者相比，患者外周血血小板的細胞凋亡率也較高(圖8G)。

圖8 來自Col6相關疾病患者的Mks表現出細胞凋亡增加、內質網應激和自噬缺陷

實驗方法

        細胞培養；動物建模；RT-qPCR；Western blotting；細胞轉染；免疫熒光；小動物成像；流式細胞術；

參考文獻：

        Abbonante V, Malara A, Chrisam M, Metti S, Soprano P, Semplicini C, Bello L, Bozzi V, Battiston M, Pecci A, Pegoraro E, De Marco L, Braghetta P, Bonaldo P, Balduini A. Lack of COL6/collagen VI causes megakaryocyte dysfunction by impairing autophagy and inducing apoptosis. Autophagy. 2023 Mar;19(3):984-999. doi: 10.1080/15548627.2022.2100105. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35857791; PMCID: PMC9980446.