KRAS突變與促腫瘤炎癥有因果關系，并被確定為腫瘤發生的驅動因素。在這里，使用從大量患者收集的多組學數據，作者發現KRAS突變與與肝內膽管癌(iCCA)髓系炎癥相關的選擇性mRNA剪接的特定景觀相關。然后，作者確定了一種負反饋機制，其中白細胞介素1受體拮抗劑(IL1RN)-201/203由于選擇性剪接而上調，在KRAS突變體iCCA中具有重要的抗炎作用。在KRAS突變型iCCA小鼠中，IL1RN201/203上調和anakinra治療通過改變中性粒細胞募集和表型引發了顯著的抗腫瘤免疫應答。此外，anakinra治療協同增強抗PD-1治療，以激活KRAS突變型iCCA小鼠的瘤內GZMB+ CD8+ T細胞。在臨床上，作者發現KRAS突變型iCCA患者的高IL1RN-201/203水平與抗PD-1免疫治療的良好反應顯著相關。

技術路線：

主要研究結果：

1.髓系炎癥與iCCA的選擇性剪接和KRAS突變有關

       為了發現（選擇性mRNA剪接）AS在iCCA中的潛在作用，作者獲得了內部生成和公開的大量RNA-seq數據，包括496個iCCA樣本、22個非腫瘤肝臟樣本和188個正常組織樣本(心臟、肺等)(圖1A)。來自496個iCCA樣本的轉錄組學數據共獲得303,401個轉錄本，這些轉錄本被定位為5類，包括蛋白質編碼基因(PC)、長鏈非編碼RNA(LNC)、假基因(PS)、未注釋基因(UNA)和其他非編碼RNA(ONC)。將AS指數與之前的iCCA分子亞型進行了比較，結果表明，AS指數高的樣本集中在與生存較差的炎癥相關亞組中(圖1B)。考慮到作者最近提出的髓系炎癥在iCCA進展中的重要作用，利用ssGSEA進一步比較高和低AS亞組之間主要髓系細胞類型相對豐富度的差異。值得注意的是，高指數亞組有明顯更高的中性粒細胞的浸潤(圖1C)。使用TIMER算法和先前報道的中性粒細胞特征(26-29)也獲得了類似的結果(圖1C)。對基因組改變與AS指數之間可能關聯的可視化熱圖進行統計分析顯示，KRAS突變與高AS的關聯最為顯著(圖1C)，ssGSEA進一步揭示了KRAS突變可能導致中性粒細胞浸潤(圖1D)，這一點在CPTAC隊列中通過CD6+B細胞(中性粒細胞)的多重免疫組織化學(mIHC)染色得到了證實(圖1E，F)。最后，KRAS突變、高AS指數和髓系炎癥之間反復出現正相關，表明它們之間存在潛在的因果相互作用(圖1G)。綜上所述，這些結果強調了iCCA中免疫抑制性髓系炎癥、腫瘤特異性ASEs和KRAS突變之間的密切聯系。

2.KRAS突變促進IL1RN-201/203的表達和分泌

       鑒于KRAS突變與iCCA中腫瘤特異性ASEs之間的強烈關聯，作者試圖確定哪些腫瘤特異性ASEs特異性參與。特別是，IL1RN ASEs(IL1RN_MX)被確定為一個獨特的KRAS突變相關事件，使用多模態數據(圖2A)，然后通過RT-PCR分析驗證IL1RN_MX。在哺乳動物中發現了兩種主要的IL1RN結構變異，分泌型和細胞內型。在IL1RN的6個蛋白編碼轉錄本中，僅有胞內轉錄本變體IL1RN-201和IL1RN-203被發現參與IL1RN_MX，其中外顯子2a/2b的替代使用是它們之間的主要區別(圖2B)。然而，經典分泌型變異IL1RN-205未參與。KRAS突變型iCCA患者中IL1RN_MX的PSI值顯著高于無KRAS突變的患者，這可能與KRAS突變型患者中IL1RN-201比IL1RN-203上調幅度更大有關。再次，作者發現iCCA患者中IL1RN-205的表達不受KRAS突變的影響。

圖1KRAS突變與iCCAAS指數和髓系炎癥相關

       然后作者在iCCA細胞中過表達KRAS G12D，并觀察到與對照細胞相比，IL1RN-201在LICCF-KRAS細胞中的上調幅度是KRAS細胞G12D的13.93倍，而WTIL1RN-203僅上調4.15倍(圖2C)。來自CPTAC隊列的組織微陣列使用RNA熒光原位雜交(FISH)證實，KRAS突變患者的IL1RN-201和IL1RN-203分別比KRAS患者高10.89倍和6.19倍(圖2D-E)。

       先前的研究表明，細胞內的IL1RN變異也可以通過一些未被探索的途徑從細胞質中釋放出來。事實上，Western blot(WB)和ELISA檢測表明，在KRAS過G12D表達LICCF或KRAS突變體HuCCT1細胞(iCCA)中，IL1RN-201或203過表達也導致它們在培養上清中大量積累，類似于分泌的IL1RN-205。

圖2 IL1RN-201/203在KRAS突變體iCCA中的產生機制及其功能

3.IL1RN-201/203抑制KRAS突變介導的髓系炎癥

       作為與KRAS突變相關的事件，IL1RN_MX的PSI與iCCA患者炎癥因子(CXCL3、CXCL5、IL1β等)、中性粒細胞、MAPK通路基因水平呈顯著正相關(圖2F)。考慮到IL1RN的抗炎作用，作者假設IL1RN-201/203可能通過負反饋調節潛在地對抗KRAS突變體相關的髓系炎癥。

       為了驗證這種可能性，作者構建了IL1RN-201特異性敲低的LICCF-KRAS G12D細胞(shIL1RN-201)。Transwell實驗顯示，shIL1RN-201 LICCF-KRASG12D細胞中的中性粒細胞暴露于條件培養基中，其遷移能力明顯高于對照細胞(圖2G)。相反，中性粒細胞暴露于IL1RN-201或203過表達HuCCT1細胞的條件培養基中，其遷移量明顯低于載體對照HuCCT1細胞(圖2G)。此外，ELISA定量分析表明，shIL1RN-201或ASOIL1RN-201LICCF-KRAS細胞中CXCL3水平顯著高于對照組，而G12D過表達IL1RN-201或203的HuCCT1細胞中CXCL3水平顯著低于載體對照組(圖2H)。總之，這些數據表明IL1RN-201/203變體確實在KRAS突變型iCCA中起關鍵的抗炎作用。

       WB分析進一步證實，IL1RN-201敲低后，ERK1/2磷酸化顯著增強，但被其過表達抑制(圖2I)。此外，ELISA檢測顯示，在shIL1RN-201LICCF-KRASG12D細胞、HuCCT1和ASOIL1RN-201LICCF-KRASG12D細胞中，曲美替尼(MEK-ERK途徑抑制劑)治療后，CXCL3水平降低(圖2J)。同樣，在shIL1RN-201LICCFKRASG12D、HuCCT1或ASOIL1RN-201LICCF-KRAS細胞中，使用抗CXCL3AB或AZD-5069(一種CXCR2抑制劑)治療后，transwell實驗中的趨化能力也受到抑制(圖2K)。總的來說，這些發現表明IL1RN-201或203變體對ERK1/2-cxcl3中性粒細胞募集軸有顯著影響。

       接下來，作者研究了IL1RN-201或il1rn-203上游調控的可能機制。對CPTAC隊列轉錄組學和蛋白質組學數據集的剪接因子進行交叉分析，發現6個剪接因子在iCCA中低表達，同時存在KRAS突變和高AS指數，其中2個剪接因子在LICCF-KRAS細胞中也顯著低表達，G12D其中TFIP11的下調最為顯著(圖2L)。LICCF-KRAS細胞中TFIP11的過表達導致IL1RN_MX的PSI值顯著G12D降低(圖2M)。此外，作者發現TFIP11與在曲美替尼處理的LICCF-KRASG12D和HuCCT1細胞中上調，但不上調p38抑制劑或JNK抑制劑(SP600125)，提示ERK1/2磷酸化對TFIP11表達的調節作用(圖2N)。同樣，在曲美替尼治療的情況下，LICCF-KRASG12DandHuCCT1細胞中的TFIP11敲低也顯著增加了IL1RN_MX的PSI值(圖2O)。

       綜上所述，這些結果支持KRAS突變可以激活ERK1/2信號，從而觸發iCCA中以CXCL3中性粒細胞募集軸為特征的髓系炎癥。另一方面，ERK1/2磷酸化抑制剪接因子TFIP11，從而挽救IL1RN_MX的PSI值(即IL1RN-201/203的表達)，以負反饋的方式進一步抵消ERK信號(圖2P)。

4.IL1RN-201/203通過抑制KRAS突變型iCCA小鼠的中性粒細胞浸潤來抑制腫瘤進展

       為了評估IL1RN-201/203上調在體內的影響，作者基于以往的研究建立了4個小鼠模型。RNA-seq分析表明，KRAS突變型YAK小鼠中與MAPK信號通路相關的DEGs顯著富集，與患者隊列中的數據一致(圖3C)。此外，YAK小鼠的中性粒細胞趨化和遷移途徑也上調(圖3C)，同時，在YAK腫瘤樣本中，富含“MAPK級聯負調控”的DEGs普遍上調(圖3C)。這一結果與在KRAS突變型iCCA患者中觀察到的ERK激活的負反饋反應一致。此外，與IL1RN-201和204相似，iCCA腫瘤負荷原位評估顯示，過表達人源性IL1RN-201或203的YAK或KP腫瘤的腫瘤生長顯著降低(圖3D)，而在未發生KRAS突變的YA或FA腫瘤中，無論IL1RN-201或203的表達如何，腫瘤負荷均未檢測到差異(圖3E)。IL1RN-201或203的過表達也導致YAK動物的總存活率更高(圖3F)。同樣，作者發現白細胞介素1受體拮抗劑anakinra在YAK小鼠(圖3D和圖3F)而不是YA小鼠(圖3E)中也具有相應的腫瘤抑制作用。

       接下來，作者評估了過表達IL1RN-201/203或用anakinra治療的小鼠腫瘤中中性粒細胞的積累。scRNA-seq(圖3G)和免疫組織化學(IHC;圖3H)分析顯示，與對照組相比，IL1RN-201/203過表達或anakinra處理的YAK或KP小鼠腫瘤中中性粒細胞的比例和密度顯著降低。值得注意的是，在中性粒細胞缺失的小鼠中，無論阿那白拉治療還是IL1RN-201/203過表達，腫瘤負荷和小鼠存活率都是相似的(圖3IJ)。同樣，作者生成了YAK原位腫瘤轉基因小鼠，將白喉毒素(DT)應答的2A-DTRGFP肽序列插入到Ly6G的停止密碼子中，以有效消除中性粒細胞，參考先前的報道。在這些小鼠中，IL1RN-201/203過表達和anakinra治療均未對腫瘤負荷產生明顯影響(圖3K)。然后，作者在YAK模型小鼠中測試了AZD5069的作用，發現AZD-5069顯著抑制中性粒細胞向腫瘤募集，并消除IL1RN-201/203過表達對腫瘤進展的有益作用(圖3L)。這些數據表明，在體內，IL1RN-201/203對KRAS突變體iCCA的影響依賴于中性粒細胞。

圖3 IL1RN-201/203對KRAS突變型iCCA小鼠的影響

5.IL1RN-201/203重編程中性粒細胞達到抗腫瘤表型

       腫瘤相關的中性粒細胞表現出功能異質性和可塑性，包括抗腫瘤或促腫瘤表型。scRNA-seq分析在小鼠iCCA腫瘤中鑒定出6個中性粒細胞簇(圖4A)。然后，作者重點研究了小鼠腫瘤中檢測到的3種主要中性粒細胞簇(即CXCL2+，CXCR4+和LSP1+中性粒細胞，共占92.12%)，通過無偏倚的綜合跨物種分析，這些中性粒細胞簇的組成和特征基因表達在人和小鼠之間很大程度上是保守的。在通過mIHC驗證了這些簇在YAK腫瘤中的存在后(圖4B)，作者進行了表型分析，以更好地了解它們在KRAS突變體iCCA中的作用。

圖4 IL1RN-201/203對KRAS突變型iCCA小鼠中性粒細胞表型的影響

       然后，作者研究了IL1RN-201/203表達或anakinra治療是否以及如何影響牦牛小鼠的這些中性粒細胞簇。作者發現，在anakinra治療或過表達IL1RN-201/203的腫瘤中，CXCL2中性+粒細胞的比例顯著升高，但CXCR4+和LSP1+中性粒細胞的比例較低(圖4C)。RNA速度分析證實，CXCL2中性粒細胞+的明顯增加是由于CXCR4+和LSP1+中性粒細胞的加速轉化(圖4D)。重要的是，KRAS突變相關的髓系細胞發育和分化在CXCR4+和LSP1+中性粒細胞++中明顯減弱(圖4E)，而抗腫瘤免疫反應，如IFN-γ反應和T細胞活化，在所有3個中性粒細胞簇中都增強(圖4F)。這些結果表明，IL1RN201/203過表達或anakinra治療可能是中性粒細胞重編程以誘導腫瘤對T細胞敏感性的有效策略。

6.IL1RN-201/203促進KRAS突變型iCCA小鼠GZMB+ CD8+T細胞浸潤

       隨著中性粒細胞組成和功能的改變，免疫組化分析表明，在YAK和KP模型中，IL1RAN-201/203或anakinra治療組與對照組相比，瘤內CD3+T細胞群顯著擴增(圖5A)。然后，作者在Rag1-/-YAK模型中檢測腫瘤負荷，該模型缺乏成熟的T細胞和B細胞。正如預期的那樣，anakinra或IL1RAN-201/203治療組的小鼠在腫瘤發展方面沒有差異對照rag1-/-小鼠(圖5B)。隨后的mIHC分析顯示，在IL1RAN-201/203或anakinra處理組中，YAK和KP小鼠的CD8+T細胞的浸潤明顯增加，而不是CD4+T細胞和NK細胞(圖5C)。值得注意的是，在IL1RN-201/203過表達或anakinra處理的YAK和KP小鼠的腫瘤中，ly6中性粒細胞+和CD8T細胞+之間的距離明顯縮短。

       這些數據使作者想知道缺乏CD8+T細胞或其他亞群是否會影響IL1RAN-201/203或anakinra的抗腫瘤作用。HDTVi前1天通過抗CD8+B細胞清除CD8+T細胞，消除IL1RN-201/203和anakinra治療的效果(圖5D)。相比之下，CD4+T細胞或NK細胞的消耗對IL1RAN-201/203或anakinra的益處沒有明顯影響(圖5D)。這些結果表明，在KRAS+突變型iCCA小鼠中，CD8+T細胞特異性介導IL1RAN-201/203過表達或anakinra治療的抗腫瘤免疫。與IL1RN_MXPSI低KRAS突變體相比，IL1RN_MXP siKRAS突變體中CXCR4+和LSP1中性粒細胞的密度略有下降，而CXCL2中性粒細胞和GZMB CD8+T細胞+的密度則有所增加(圖5G-H)。這些觀察結果表明，重編程中性粒細胞可能與GZMB+CD8+T細胞協同發揮抗腫瘤作用。

7. Anakinra聯合抗PD-1Ab治療可增強KRAS突變體的抗腫瘤反應  

       炎癥是癌癥免疫治療效果的主要障礙(9,39)。因此，作者接下來研究了anakinra是否可以提高KRAS突變YAK小鼠的PD-1阻斷效果。與單藥治療相比，抗PD-1Ab聯合anakinra確實進一步降低了腫瘤負荷(圖6A)并提高了生存率(圖6B)。此外，作者評估了這種聯合療法是否也能使KRAS患者受益。正如預期的那樣，雖然抗PD-1治療顯著抑制腫瘤生長，但在YA小鼠中，與anakinra聯合使用沒有額外的抗腫瘤功效(圖6C-D)。

圖5 IL1RN-201/203對KRAS突變體iCCA小鼠GZMB+CD8+T細胞浸潤的影響

       此外，anakinra聯合抗PD-1Ab可進一步降低YAK模型中中性粒細胞的比例(圖6E)。然而，在抗PD-1Ab加阿那白那組中，GZMB+CD8+T細胞的比例顯著增加(圖6F)。這種效應可能是由于聯合治療組中性粒細胞中Ccl5、Cxcl9、Cxcl10或Cxcl13的表達進一步增加(圖6G)，這與實體腫瘤中CD8+T細胞通過其相應受體浸潤有關。隨后scRNA-seq分析表明，在聯合治療或anakinra單藥治療后，GZMB+CD8+T細胞中富集了一些效應記憶分子、整合素、新抗原特異性標記物、功能性轉錄因子和共刺激分子(圖6H)，這些已被用于預測癌癥免疫治療的益處。此外，抗PD-1Ab加阿那白素治療后，GZMB+CD8+T細胞中富集的生物過程與參與免疫反應、補體和凝血級聯反應以及淋巴細胞介導免疫的正向調節途徑，進一步說明了阿那白拉與抗PD-1Ab治療在KRAS突變體iCCA中的協同作用(圖6I)。這些數據提供了anakinra與抗PD-1Ab聯合使用進一步調節中性粒細胞簇、細胞毒性T細胞及其相互作用的證據。

圖6阿那白素聯合抗PD-1治療KRAS突變型iCCA小鼠的療效

8.高IL1RN-201/203水平或anakinra治療在KRAS突變患者中啟動PD-1阻斷腫瘤

       接下來，作者研究了YAK小鼠中IL1RN-201/203過表達或anakinra是否也能改善KRAS突變型iCCA患者對抗pd1免疫治療的反應。作者從本中心接受抗PD-1治療的KRAS突變型iCCA患者中收集了12例治療前活檢樣本，包括3項II期試驗(NCT04961788、NCT04669496和ChiCTR2000035901)。FISH檢測顯示，與無反應組相比，反應組中IL1RN-201/203的表達顯著升高(圖7A-B)。與作者的上述結果一致，反應組CXCR4和LSP1+中性+粒細胞密度均弱降低，而CXCL2+中性粒細胞和GZMB+CD8+T細胞密度弱增加(圖7C-D)。這些數據表明，IL1RN-201/203表達升高的KRAS突變iCCA患者具有相對有利的免疫治療TME。然后，作者分析了5種不同類型的KRAS突變頻率高(>20%)的患者的轉錄組學數據。

圖7 IL1RN-201/203或anakinra使KRAS突變癌癥對免疫治療敏感

       然后，作者使用一種新的患者源性腫瘤片段(PDTF)平臺來測試抗PD-1Ab單獨或加anakinra是否可以類似地重塑人類TME。在抗PD-1Ab±anakinra存在或不存在的情況下，對處理未成熟iCCA(n=5)和結直腸癌(n=8)手術切除的腫瘤標本進行組織切片和體外培養。通過多參數細胞因子/趨化因子陣列和ELISA檢測，在培養48小時后分析這些PDTF分泌譜的變化(圖7E)。與作者的上述結果一致，KRAS突變體樣本的基線CXCL3水平和中性粒細胞浸潤均高于KRASWT樣本。此外，與抗PD-1單藥治療的PDTF相比，接受anakinra抗PD-1+Ab聯合治療的6例KRAS突變患者的PDTF中CXCL9、CXCL10和GZMB的水平顯著升高，CXCL3等免疫抑制因子降低(圖7F)。這些結果表明，聯合治療誘導TME的快速重編程，以促進T細胞的積累和效應活性，這可能是有希望精確治療KRAS突變患者。

結論：

       本研究提出了AS的全面概況，并確定了由IL1RN選擇性剪接產生的新的炎癥檢查點，這為治療KRAS突變iCCA提供了有效的選擇。更廣泛地說，對這種負反饋回路的深入研究將揭示KRAS突變癌癥的獨特生物學，從而推動對受影響患者的靶向策略的探索。

實驗方法：

       RNA提取和RNA測序，AS指數建立，ssGSEA評估免疫細胞浸潤，富集分析，WES數據分析，scRNA測序，mIHC分析,FISH檢測，質粒和慢病毒介導的細胞系構建，ASOs轉染，Western Blot，RT-PCR，Trsanswell試驗，ELISA實驗，細胞增殖實驗，動物實驗，流式細胞術。

參考文獻：

       Zhang, M., Huang, Y., Pan, J., Sang, C., Lin, Y., Dong, L., Shen, X., Wu, Y., Song, G., Ji, S., Liu, F., Wang, M., Zheng, Y., Zhang, S., Wang, Z., Ren, J., Gao, D., Zhou, J., Fan, J., Wei, W., Gao, Q. (2023). An Inflammatory Checkpoint Generated by IL1RN Splicing Offers Therapeutic Opportunity for KRAS-Mutant Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Cancer discovery, 13(10), 2248–2269.