METTL5是一種18S rRNA甲基轉移酶，能夠提高癌癥細胞中的蛋白質合成活性，對腫瘤發生和細胞命運至關重要。先前的研究表明，缺乏METTL5的小鼠胚胎干細胞（mESC）具有較低的分化潛力和蛋白質合成速率。此外，據報道，METTL5促進乳腺癌和胰腺癌的腫瘤發生，并且METTL5缺陷導致整體蛋白質合成和S6K激活明顯降低。盡管已經證明METTL5在調節生物過程中起關鍵作用，但其在調控HCC復雜代謝重編程中的功能和分子機制仍不完全清楚。因此，為了確定METTL5與葡萄糖代謝的重編程是否存在顯著關聯，作者聯合分析了轉錄組學和代謝組學的多個層面數據，旨在確定METTL5在HCC中的臨床相關性，并闡明METTL5介導的葡萄糖代謝和HCC發展的分子過程。該研究于2023年3月發表在《Cancer Communications》，IF=16.2。

技術路線

主要研究內容

1. METTL5在HCC中上調，與預后不良相關

       TCGA-LIHC數據庫和GTEx數據庫分析顯示，METTL5轉錄水平在HCC中顯著上調（圖1A）。從GEO數據庫下載的微陣列數據同樣顯示METTL5在HCC中過表達（圖1B）。此外，作者發現METTL5轉錄水平在多種癌癥中顯著升高，尤其是HCC。根據Kaplan-Meier生存曲線，METTL5高表達的HCC患者預后較差（圖1C）。對UALCAN數據庫的分析顯示，METTL5轉錄水平與腫瘤分級和分期之間存在顯著關聯（圖1D）。從武漢大學中南醫院樣本庫隨機抽取的80對HCC組織及癌旁正常組織中METTL5表達的qRT-PCR分析顯示，HCC中METTL5轉錄本水平顯著上調，METTL5表達與腫瘤大小和TNM分期相關（圖1E和附表S3）。多因素Cox比例風險回歸分析顯示，表現為METTL5過表達的HCC患者總生存期較短，METTL5是HCC患者生存期較短的獨立危險因素（圖1F）。根據中值將HCC患者分為低表達和高表達的METTL5亞組后，Kaplan-Meier分析顯示，高METTL5表達與HCC患者的不良預后密切相關（圖1K）。Western blotting分析和免疫組化證實了HCC組織中METTL5蛋白水平的上調（圖1H-I）。與MIHA人肝細胞的表達相比，5種HCC細胞系中的METTL5 mRNA和蛋白水平增加（圖1J-K）。共聚焦激光掃描顯微鏡發現，HCC細胞中的METTL5蛋白（紅色熒光）主要是細胞質（圖1L）。這些發現表明，METTL5可能作為診斷和治療HCC的潛在生物標志物。

圖1 肝細胞癌中METTL5的上調。

2. METTL5增強了HCC細胞中的Warburg效應

       作者首先使用CRISPR/Cas9技術構建了穩定的METTL5敲除（KO）HCC細胞系（Huh-7和HCC-LM3），以研究METTL5在HCC中的潛在分子機制（圖2A）。然后，作者構建了一個Hep-G2細胞模型，該模型通過慢病毒轉導穩定地過表達METTL5。進行RNA-seq以篩選METTL5敲除后在HCC細胞系中差異表達的基因。差異表達mRNA的KEGG通路分析顯示糖酵解有相當大的富集（圖2B）。對轉錄組數據進行的GSEA顯示，METTL5大大增加了MYC信號通路和糖酵解信號通路。因此，對TCGA數據庫的GSEA分析顯示METTL5與MYC信號通路之間存在正相關。此外，作者采用基于高效液相色譜-串聯質譜的非靶向代謝組學方法檢測代謝物。METTL5-KO細胞的代謝組與METTL5-WT細胞的代謝組有顯著差異。根據代謝組學分析，METTL5-KO在代謝方面產生了顯著的變化，包括更高水平的三羧酸（TCA）循環代謝物和更低的乳酸水平（圖2C）。隨后，作者在RNA-seq數據中檢測到與糖酵解相關的差異表達基因。HCC細胞中METTL5敲除顯著抑制糖酵解基因乳酸脫氫酶A（LDHA）、烯醇化酶1（ENO1）、磷酸丙糖異構酶1（TPI1）、溶質載體家族2成員1（SLC2A1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）在mRNA和蛋白水平上的表達，而METTL5過表達則發揮相反作用（圖2D）。此外，對TCGA-LIHC數據庫和80對HCC組織的分析顯示，METTL5轉錄水平與糖酵解基因表達水平之間存在顯著的正相關。

圖2 METTL5增強了對HCC細胞的Warburg效應。

       隨后，作者測量了敲除METTL5后的葡萄糖攝取和乳酸產生，以系統地研究METTL5激活是否促進HCC中的有氧糖酵解（Warburg效應）。這種糖酵解表型被葡萄糖吸收和乳酸生成減少所抑制。正如預期的那樣，沉默METTL5顯著降低了葡萄糖攝取和乳酸生成。已經觀察到酸性腫瘤微環境（較低的pH值）是由乳酸過量產生引起的，這促使腫瘤細胞轉移。因此，乳酸合成減少限制了酸性腫瘤微環境的形成，如培養基pH值增加所示。此外，糖酵解基因的下調抑制了腫瘤細胞中線粒體OXPHOS向糖酵解的轉化。增強的OXPHOS導致耗氧量增加。結果表明，敲除METTL5抑制了葡萄糖攝取和乳酸生成，增加了HCC細胞的pH值和耗氧量，而METTL5過表達則發揮了相反的作用（圖2E-H）。接下來，作者測量了HCC細胞中的ECAR。METTL5敲除顯著損害了HCC細胞系的糖酵解，而METTL5過表達則產生了相反的結果（圖2I）。作者監測線粒體質量以評估代謝反應；METTL5敲除顯著增加HCC細胞中線粒體DNA（mtDNA）含量，而METTL5過表達則發揮相反作用（圖2J）。此外，MitoSceneTM系列綠色Ι和Mito Tracker TM系列紅染結果顯示，METTL5敲除增強了HCC細胞的線粒體功能，而METTL5過表達抑制了線粒體功能（圖2K）。據報道，活性氧-氮（RONS）的產生以及缺氧和酸性腫瘤微環境觸發線粒體功能障礙并通過Warburg效應增強線粒體自噬。線粒體自噬是一種降解受損線粒體的巨自噬形式，是線粒體對各種應激和代謝紊亂的適應性反應。作者進一步探討了METTL5是否通過線粒體自噬調節mtDNA和線粒體功能。首先，作者分析了自噬體標志物的蛋白水平，如P62、Parkin、微管相關蛋白1輕鏈3β-1（LC3B-I）和LC3B-II。P62是一種線粒體自噬接頭蛋白，其還原表明線粒體自噬。Western blotting結果顯示，METTL5敲除下調了Parkin和LC3B-II的表達，但上調了P62的表達（圖2L）。敲除METTL5后，TEM顯示自噬體和線粒體減少。根據這些發現，METTL5增加了糖酵解，同時降低了HCC細胞中的線粒體OXPHOS，這與Warburg效應一致。

3. c-Myc在葡萄糖代謝的重編程中起著至關重要的作用

       根據之前的一項研究，轉錄因子在調節糖酵解代謝中起著至關重要的作用。作者假設METTL5通過誘導轉錄因子的表達來促進糖酵解基因的轉錄。作者使用UCSC和JASPAR數據庫來預測與糖酵解基因LDHA、ENO1、TPI1、SLC2A1和PKM2結合的轉錄因子。c-Myc、缺氧誘導因子1亞基α（HIF-1α）和MYC相關鋅指蛋白（MAZ）可能是這些糖酵解基因的轉錄因子。結果表明，METTL5敲除降低了c-Myc蛋白的表達，但不影響c-Myc、HIF-1α或MAZmRNA的表達或HIF-1α和MAZ蛋白的表達，這與GSEA結果一致（圖3A）。因此，作者懷疑c-Myc可能是將METTL5與糖酵解聯系起來的鉸鏈。c-Myc過表達減弱了METTL5敲除介導的糖酵解基因下調（圖3B-C）、葡萄糖攝取和乳酸產生下調（圖3D-E）、pH值和耗氧量上調（圖3F-G）和ECAR的下調（圖3H）。此外，c-Myc過表達減弱了METTL5敲除介導的線粒體呼吸和質量增加（圖3I-K系列）。這些結果支持了METTL5調節c-Myc表達以調節糖酵解活性的假設。

圖3 c-Myc在重編程葡萄糖代謝中起著至關重要的作用。

4. METTL5以m6A依賴性方式促進泛素特異性肽酶5（USP5）翻譯

       根據前期的結果，METTL5敲除顯著降低了c-Myc蛋白的表達。此外，多核糖體分離分析表明，在METTL5-KO細胞中，c-Myc的翻譯沒有顯著改變。根據先前的報道，多種泛素結合酶（泛素連接酶）和去泛素化酶通過蛋白酶體系統相互作用并調節c-Myc降解。作者使用翻譯抑制劑CHX評估了c-Myc蛋白的穩定性，并證實METTL5延長了c-Myc蛋白的半衰期（圖4A）。用蛋白酶體抑制劑MG132進行預處理可防止c-Myc穩定性的提高（圖4B），表明METTL5敲除破壞了c-Myc的穩定性，導致其被蛋白酶體降解。隨后的泛素化試驗表明，METTL5過表達降低了c-Myc的泛素化和降解（圖4C）。

       作者進行了co-IP和MS鑒定了與HCC中c-Myc相互作用的潛在蛋白質，并研究了METTL5敲除如何促進c-Myc泛素化和降解（圖4D）。作者無法鑒定出任何與c-Myc相互作用的METTL5肽。然而，有趣的是，作者發現含有7（FBW7）、F‐box蛋白32（FBXO32）、S期激酶相關蛋白2（SKP2）、USP7、USP37、USP28、USP36和含有32的三聯基序（TRIM32）的USP5、F-box和WD重復結構域與c-Myc強烈相互作用。此外，METTL5敲除降低了USP5蛋白的表達，但沒有顯著改變其他去泛素化和泛素化相關蛋白的表達和翻譯水平（圖4E）。

       METTL5通過甲基化18S rRNA來調節核糖體功能，METTL5-KO細胞的蛋白質比親本對照細胞少約30%。作者使用METTL5-WT和METTL5-KO細胞的提取物進行多核糖體分離分析，以確定METTL5是否對USP5翻譯有影響。結果表明，METTL5敲除對GAPDH mRNA譜沒有影響，而USP5 mRNA從較重的多核糖體組分轉移到較輕的組分（圖4F）。這一結果表明，METTL5敲除抑制了USP5 mRNA的翻譯。因此，作者研究了USP5翻譯活性是否依賴于METTL5甲基化酶活性。敲除METTL5后，總RNA的m6A水平顯著降低，如斑點印跡所示（圖4G）。分離rRNA和mRNA后，LC/MS顯示METTL5敲除顯著降低了18S rRNA的m6A水平，但對mRNA的m6A水平沒有影響（圖4H）。此外，METTL5-KO細胞和METTL5-WT細胞之間c-Myc的m6A甲基化水平沒有差異。然后，作者構建了一個沒有酶活性的METTL5突變體。有趣的是，血凝素（HA）-METTL5-WT的過表達減弱了METTL5敲除對USP5的影響，但HA-METTL5-Mut的過表達并不能挽救USP5蛋白的表達（圖4I）。因此，USP5的翻譯直接依賴于METTL5 18S rRNA甲基轉移酶活性。據報道，METTL3-METTL14復合物是一種眾所周知的mRNA m6A甲基轉移酶復合物，在體外也介導DNA m6A甲基化（m6DA）。然而，沒有報告表明METTL5是否參與DNA甲基化。在METTL5-WT和METTL5-KO細胞中，作者檢測到基因組DNA的m6DA區域的修飾。作者無法檢測到METTL5敲除后的m6DA變化。使用雙熒光素酶報告基因測定，作者隨后確定METTL5對USP5啟動子活性沒有影響。結果表明，METTL5是一種純RNA甲基化酶，對DNA甲基化沒有調控作用。

圖4 METTL5以m6A依賴性方式促進USP5翻譯。

5. METTL5介導的c-Myc穩定需要USP5依賴性去泛素化

       作者假設METTL5通過USP5穩定c-Myc。USP5是一種去泛素化酶，對蛋白質的穩定性和功能至關重要。去泛素化酶USP5的底物介導基本的生物學功能，包括細胞存活、增殖和死亡。然而，沒有報道描述USP5如何去泛素化c-Myc。USP5敲低顯著降低了HCC細胞系中的c-Myc蛋白水平。然后，作者研究了USP5是否通過去泛素化來穩定c-Myc。免疫熒光共定位和核質分離表明，c-Myc定位于核質中，USP5存在于細胞質和核質中（圖5A‐B），表明c-Myc和USP5主要共定位在細胞核中。隨后，使用內源性和外源性Co-IP測定顯示了USP5和c-Myc之間的相互作用（圖5C-D）。谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）下拉試驗進一步證實，從細菌中純化的GST-c-Myc（而非GST）下拉重組His-USP5（圖5E）。重要的是，USP5過表達顯著提高了c-Myc蛋白的穩定性，同時降低了c-Myc泛素化（圖5F-G）。蛋白酶體抑制劑MG132預處理抑制了c-Myc水平的增加。USP5是一種～120kDa蛋白，具有五個不同的結構域：兩個ZnF結構域（1-168;169-289）、一個C盒結構域（290-624）、一個UBA1/UBA2結構域（625-749）和一個H盒結構域（750-835）。為了研究USP5的哪個結構域與c-Myc相互作用，將293T細胞與Flag-USP5和HA-c-Myc的不同結構域共轉染，作者的結果表明只有U3和U4直接與c-Myc蛋白結合（圖5H）。此外，USP5在K48鍵處抑制c-Myc多泛素化，但在其他鍵處不抑制c-Myc多泛素化（圖5I）。當K48泛素化位點（K48R）發生突變時，USP5介導的c-Myc泛素化被消除（圖5J）。這些結果表明，USP5特異性結合c-Myc并保護c-Myc免受多泛素化介導的降解。最后，在METTL5敲除存在下，USP5的過表達消除了METTL5對c-Myc的影響。這些數據表明，METTL5介導的c-Myc穩定需要USP5依賴性去泛素化。此外，作者使用免疫組化和蛋白質印跡法測定了HCC組織樣本中METTL5、c-Myc和USP5蛋白的含量。根據相關性研究，METTL5蛋白水平與USP5和c-Myc蛋白水平呈正相關。與附近的正常肝組織相比，METTL5、USP5和c-Myc在HCC組織中表達強烈。最后，對TCGA-LIHC數據庫和20對HCC組織的分析表明，USP5和c-Myc轉錄水平與糖酵解基因表達水平呈正相關。

圖5 USP5是c-Myc的去泛素化酶。

6. METTL5促進HCC生長和轉移

       接下來，作者研究了METTL5敲低和過表達對HCC細胞增殖和遷移的影響，以進一步探討METTL5在HCC中的功能。CCK-8、EdU和集落形成試驗顯示，METTL5敲除顯著降低細胞增殖，METTL5過表達增加增殖（圖6A-C）。Transwell和劃痕愈合試驗顯示，METTL5敲除抑制細胞侵襲和遷移，METTL5過表達增加侵襲和遷移（圖6D-E）。癌細胞必須經歷上皮間充質轉化（EMT）才能開始轉移。因此，作者研究了METTL5是否對HCC細胞中的EMT有影響。qRT-PCR和Westernblotting結果顯示，敲除METTL5下調間充質標志物（N-鈣粘蛋白、纖連蛋白和波形蛋白）的表達，但上調E-鈣粘蛋白的表達。相反，其過表達顯示出相反的效果。這些結果表明METTL5促進了EMT。此外，METTL5缺失大大提高了細胞凋亡率，但對細胞周期沒有影響（圖6F）。構建HCC皮下異種移植模型、原位HCC小鼠模型、尾靜脈注射肺轉移模型和腹部轉移模型，進一步研究METTL5在體內的作用。METTL5-KO組腫瘤生長和體重均顯著低于METTL5-WT組（圖6G網絡）。免疫組化分析顯示，METTL5-KO組Ki-67和糖酵解基因表達低于METTL5-WT組（圖6H）。TUNEL標記顯示，METTL5-KO組的細胞凋亡率明顯高于METTL5-WT組（圖6I）。在原位HCC小鼠模型中，METTL5-KO組的腫瘤生長明顯慢，糖酵解基因表達比METTL5-WT組低得多（圖6J）。肺轉移腫瘤模型和腹部腫瘤轉移模型顯示，敲除METTL5顯著降低了轉移灶的平均生物發光強度和轉移性結節數量（圖6K-L）。基于這些結果，METTL5在體外和體內促進了HCC細胞的增殖和侵襲。

圖6 METTL5促進HCC生長和轉移。

7. METTL5的腫瘤促進功能取決于c-Myc介導的葡萄糖代謝重編程

       由于葡萄糖代謝異常與HCC的進展有關，作者試圖進一步確定c-Myc是否是METTL5介導的HCC進展的下游效應子。作者在METTL5-KO細胞系中過表達c-Myc來驗證這一假設。一系列表型測試表明，在沒有METTL5的情況下，c-Myc過表達降低了對Huh-7和HCC-LM3細胞增殖和侵襲的抑制（圖7A-E）。作者進一步驗證了c-Myc在裸鼠METTL5介導的HCC進展中的作用，發現METTL5敲除的作用確實被c-Myc過表達逆轉（圖7F-I）。這些結果表明，c-Myc對METTL5介導的HCC的體外發生和轉移具有重要意義。

       最后，作者在METTL5-KO細胞系中過表達USP5，以確定USP5的關鍵作用。一系列表型實驗表明，在沒有METTL5的情況下，USP5過表達減弱了對Huh-7和HCC-LM3細胞增殖和侵襲的抑制作用。此外，作者在體內驗證了USP5參與METTL5介導的HCC進展，發現USP5過表達逆轉了METTL5敲低對c-Myc表達和增殖的抑制作用（圖7J-K）。這些數據表明，USP5對METTL5介導的HCC癌癥促進功能至關重要。

圖7 METTL5的腫瘤促進功能取決于c-Myc。

8. cAMP反應性元件結合蛋白1（CREB1）/P300促進METTL5轉錄

       使用GeneCards、UCSC和JASPAR數據庫進行計算機模擬研究，以確定與HCC中METTL5上調相關的潛在上游轉錄因子。CREB1、E74樣ETS轉錄因子1（ELF1）和CCAAT增強子結合蛋白β（CEBPB）是METTL5的主要轉錄因子，由于CREB1敲低降低了METTL5mRNA和蛋白表達，因此選擇CREB1進行進一步研究（圖8A-B），但ELF1或CEBPB敲低沒有。CREB1轉錄因子的DNA結合基序是從JASPAR獲得的（圖8C）。作者生成了一系列截短的METTL5啟動子-熒光素酶構建體，以闡明CREB1介導的METTL5轉錄。熒光素酶報告基因檢測結果顯示，METTL5基因中堿基對1400至2100的啟動子區域包含一個CREB1反應位點（圖8C）。因此，作者通過在堿基1554和1565之間順序突變預測的METTL5啟動子序列來構建METTL5-WT和METTL5-Mut啟動子熒光素酶報告載體。CREB1過表達增加了METTL5-WT載體的相對熒光素酶活性，但對METTL5-MUT載體的熒光素酶活性影響最小（圖8D）。此外，ChIP研究表明METTL5啟動子區域與CREB1相互作用（圖8E）。如這些結果所示，CREB1通過與METTL5啟動子區域結合來增強HCC中METTL5的表達。

       此外，作者還研究了CREB1在HCC有氧糖酵解中的關鍵調控作用。對TCGA-LIHC數據庫的分析顯示，CREB1轉錄水平在HCC中顯著上調（補充圖S19A）。qRT-PCR和Westernblotting分析驗證了HCC組織中CREB1mRNA和蛋白水平的上調。此外，TCGA-LIHC數據庫的研究表明，CREB1轉錄水平與糖酵解基因表達水平呈正相關。HCC細胞中CREB1敲除在mRNA和蛋白質水平上顯著抑制糖酵解基因LDHA，ENO1，TPI1，SLC2A1和PKM2的表達。TCGA數據庫結果與中南醫院80對HCC組織的相關性分析顯示，METTL5表達與CREB1表達呈正相關。

       據報道，E1A結合蛋白p300（p300）作為CREB1轉錄因子的共激活因子發揮作用，并直接與CREB1相互作用以增強其活性[30].熒光素酶報告基因試驗表明，p300可能獨立工作以刺激METTL5啟動子上的METTL5轉錄和CREB1活性（圖8H）。值得注意的是，當CREB1和p300共表達時，與單獨使用基礎啟動子相比，METTL5轉錄提高了30倍。這個量明顯超過累加量，這意味著CREB1和P300具有功能協同作用。由于METTL5啟動子結合位點的突變，這種效應消失了。此外，ChIP分析結果顯示p300不能與METTL5啟動子區域結合。總的來說，這些結果表明p300在METTL5啟動子上作為CREB1共激活因子發揮作用。

圖8 CREB1促進METTL5轉錄。

9.METTL5敲除抑制PDX模型中的肝腫瘤生長

       由于PDX與患者的實際臨床標本驚人相似，PDX正迅速成為臨床藥物研究的黃金標準。將從第二代PDX模型中解剖的肝癌組織植入NCG小鼠體內，以評估METTL5敲除是否對PDX模型產生類似的影響（圖9A-B）。腺病毒介導的敲除METTL5具有良好的抗腫瘤作用（圖9C-D）。通過蛋白質印跡法證實了METTL5敲除效率（圖9E）。

圖9 METTL5-KO在HCCPDX模型中的顯著抗腫瘤作用。

       在治療期間，所有小鼠的體重保持相似（圖9F）。AAV-METTL5-KO組Ki-67表達較低，細胞凋亡率較高（圖9G）。METTL5敲除顯著延長了生存時間（圖9H）。當結合其他結果時，PDX模型中METTL5敲除的顯著腫瘤抑制作用為METTL5敲除在臨床開發中的巨大潛力提供了強有力的證據。根據集體數據，作者得出結論，METTL5被CREB1/P300激活，通過促進USP5翻譯減少c-Myc泛素化，從而導致HCC惡性進展（圖9I）。

結語

       作者的研究結果為METTL5過表達對HCC的細胞內在影響提供了新的視角，這意味著，除了在RNA甲基化中眾所周知的作用外，METTL5還通過許多促癌USP5-c-Myc信號級聯調節HCC細胞的增殖和遷移。作者的研究結果為腫瘤代謝相關靶點提供了新的見解，并為未來開發新的HCC治療方法提供了思路。

實驗方法

細胞培養，免疫熒光，免疫組化染色，蛋白質印跡分析，免疫共沉淀（co-IP），泛素化分析，質粒、siRNA、慢病毒構建和細胞轉染，蛋白表達和純化，CCK-8測定，菌落形成測定，劃痕傷口愈合運動試驗，transwell侵襲試驗，細胞凋亡和細胞周期分析，TUNEL染色，小鼠和體內實驗，RNA測序（RNA-seq），線粒體形態分析，細胞外酸化率（ECAR）測量，非靶向代謝組學，液相色譜-質譜（LC/MS），雙熒光素酶測定，染色質免疫沉淀（ChIP）測定，多核糖體分析，透射電子顯微鏡（TEM）

參考文獻

Xia P, Zhang H, Lu H, Xu K, Jiang X, Jiang Y, Gongye X, Chen Z, Liu J, Chen X, Ma W, Zhang Z, Yuan Y, METTL5 stabilizes c-Myc by facilitating USP5 translation to reprogram glucose metabolism and promote hepatocellular carcinoma progression. Cancer Commun (Lond). 2023; 43(3): 338-364.