近年來，開發BMSCs來源外泌體(EXO)治療骨肉瘤(OS)是一種安全且有前景的骨肉瘤治療方式，它可以在體內有效地將藥物輸送到腫瘤細胞中。然而，所攜帶藥物的差異以及EXO與其他器官的結合限制了它們的治療效果。因此，提高BMSCs EXO靶向OS的能力，開發新藥，對OS靶向治療的臨床應用至關重要。在這項研究中，我們利用骨靶向肽SDSSD修飾BMSCs EXO，并在外殼內封裝卷曲霉素(CAP)，構建了一個潛在的治療納米平臺。這些構建的納米顆粒(NPs)顯示出同源靶向能力，骨靶向外泌體(BT-EXO)顯著促進體外細胞內吞作用和體內腫瘤積累。此外，構建的NPs通過促進活性氧(ROS)的過度積累、Fe2+聚集和脂質過氧化誘導OS細胞鐵死亡，并進一步確定了鐵死亡的潛在抗癌分子機制，該機制通過Keap1/Nrf2/GPX4信號通路轉導。此外，這些構建的NP導向的鐵死亡在體內表現出明顯的腫瘤生長抑制作用，沒有明顯的副作用。這些結果表明，這些構建的NPs在小鼠骨肉瘤模型中具有良好的體外和體內抗癌活性，為骨肉瘤以鐵死亡為基礎的化療與靶向治療相結合提供了一種新的、有前景的策略。本文于2023年9月發表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.2）上。

技術路線

結果

1）BT-EXOs-CAP的生成與表征

       我們使用超離心技術從BMSCs培養基中分離出EXO，在EXO上標記骨靶向肽(SDSSD)，然后使用超高速振蕩促進CAP進入BT-EXO(圖1A-1B)。通過TEM和大小分布分析對EXO、BT-EXO和BT-EXO-CAP進行表征(圖1C-1D)。WB結果顯示，EXO、BT-EXO和BT-EXO-CAP均表達EXO特異性抗原TSG101和CD9/63/81，而內質網特異性抗原calnexin表達缺失，β-actin表達低(圖1E)。在-80℃下保存8周后，BT-EXO的平均粒徑保持在100 nm, BT-EXO-CAP的平均粒徑保持在110 nm(圖1F)。本研究考慮OS的弱酸性微環境，考察了pH 7.4和pH 4.5時BT-EXO-CAP的藥物釋放動力學，發現在弱酸性條件下，BT-EXO-CAP的藥物釋放速度明顯加快(圖1G)。

2）BT-EXOs的加載促進了CAP向OS的靶向

       為了實現CAP的藥物追蹤，我們使用CY5.5熒光標記CAP，然后將其加載到BT-EXO中(圖2A)。在體外，BT-EXO加載加速了CAP-CY5.5進入OS細胞(圖2B-2C)。在體內，BT-EXO負載有助于CAP-CY5.5靶OS，并減少CAP-CY5.5在肺部的積累(圖2D-2F)。

3）BT-EXO-CAP體外抗OS作用

       我們比較了BT-EXO、CAP和BT-EXO-CAP對4種OS細胞系藥物孵育72 h后存活率的影響，發現BT-EXO-CAP顯著抑制OS細胞的存活(圖3A)。同時，我們比較了CAP和BT-EXO-CAP的一半最大抑制濃度，發現BT-EXO-CAP的IC50明顯低于CAP(圖3B)。BT-EXO-CAP抑制人OS細胞的增殖、集落形成和侵襲(圖3C-3E)。流式細胞術還發現BT-EXO-CAP誘導G2/M期細胞周期阻滯(圖3F)。

4）BT-EXO-CAP誘導OS細胞鐵死亡

       RNA-Seq分析表明可能與線粒體自噬有關(圖4A-4E)，透射電鏡下BT-EXO-CAP處理后，線粒體變小，雙膜密度增加，線粒體脊消失，外膜破裂(圖5A)。BT-EXO-CAP誘導細胞內Fe2 +濃度升高和ROS積累(圖5B-5C)，促進細胞膜脂質過氧化(圖5D)。WB結果顯示，BT-EXO-CAP過表達ACSL4、TFRC和ALOX4，抑制GPX4、SLC7A11和FTH1(圖5E)。BT-EXO-CAP降低OS細胞GSH濃度(圖5F)。這些結果表明，BT-EXO-CAP促進OS的鐵死亡。鐵死亡激動劑(fer1)逆轉了BT-EXO-CAP對OS的生存抑制(圖5G)，降低了細胞內Fe2 +濃度(圖5H)，阻止了細胞膜脂質過氧化(圖5I)并增加了GSH濃度(圖5J)。

5）BT-EXO-CAP激活Keap1/Nrf2/GPX4信號通路導致OS細胞鐵死亡

       Nrf2是調控GPX4表達的重要上游轉錄因子。BT-EXO-CAP上調Nrf2拮抗劑Keap1的表達，下調Nrf2和GPX4的表達(圖6A-6B)。此外，發現BT-EXO-CAP抑制Nrf2從細胞質進入細胞核(圖6C)。我們利用慢病毒構建了Nrf2過表達的143B細胞系(圖6D-6E)，發現Nrf2過表達有效地逆轉了BT-EXO-CAP誘導的Fe2 +聚集(圖6F)、脂質過氧化(圖6G)和GSH減少(圖6H)。

6）BT-EXO-CAP抗OS的體內療效

       本研究從5周齡裸鼠143B腫瘤細胞植入7天后開始，連續給藥BT-EXO-CAP 21天(圖7A)。結果顯示，BT-EXO-CAP對OS生長的抑制作用明顯高于CAP(圖7B-7D)。BT-EXO-CAP和CAP處理組表現出FTH1和GPX4抑制，ASCL4和TFRC過表達，提示促進鐵死亡(圖7E)。與對照組相比，給予BT-EXO-CAP和CAP的小鼠表現出顯著的體重減輕(圖7F)，并表現出延長的生存時間。BT-EXO-CAP組的存活率最高(圖7G)。HE染色結果顯示，BT-EXO-CAP治療后器官組織未見明顯病理改變。此外，ALT、AST、BUN、CREA、CK和CK-MB的表達水平與對照組相比無顯著差異(圖7H-7I)。因此，BT-EXO-CAP和CAP沒有表現出明顯的毒性水平。

結論

       我們成功構建了一個新興的納米顆粒，通過用骨靶向肽修飾BMSCs來源的EXO來獲得OS靶向能力。該納米顆粒可實現體內OS呈現，抑制腫瘤生長，提高生存率，無明顯副作用。該納米顆粒激活Keap1/Nrf2/GPX4信號通路可誘導OS中的鐵死亡。

實驗方法

骨靶向外泌體納米顆粒構建，藥物釋放試驗，流式，細胞毒性試驗，集落形成，傷口愈合試驗，Transwell，RNA測序，ROS測量，WB，Nrf2過表達慢病毒轉染，動物實驗，細胞毒性評價。

參考文獻

Chen W, Li Z, Yu N, Zhang L, Li H, Chen Y, Gong F, Lin W, He X, Wang S, Wu Y, Ji G. Bone-targeting exosome nanoparticles activate Keap1 / Nrf2 / GPX4 signaling pathway to induce ferroptosis in osteosarcoma cells. J Nanobiotechnology. 2023 Sep 30;21(1):355. doi: 10.1186/s12951-023-02129-1.