背景
       接近70%的卵巢癌（OC）患者在接受一線治療后仍然會復發，并且腫瘤對含鉑化療會有很強的耐藥性。因此探究卵巢癌鉑類化療耐藥的機制是很有必要的。circRNA通過不同的功能機制，包括miRNA海綿、RNA結合蛋白(RBP)相互作用、基因轉錄和翻譯調節因子以及編碼功能肽，在癌癥的增殖、轉移和化療耐藥中發揮著關鍵作用。本文于2022年3月發表于《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，IF=10.9。
技術路線

結果

1.circITGB6水平升高與卵巢癌化療耐藥和不良預后相關

       CircRNA-seq顯示，與化療敏感OC組織相比，化療耐藥OC組織中共有30個circRNA發生顯著改變（圖1a）。為進一步鑒定與順鉑(CDDP)耐藥相關的circRNAs，作者采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術檢測了40OC組織中前10位上調circRNAs的表達水平。來自化療耐藥的OC患者的腫瘤比來自未表現出術后CDDP耐藥的患者的腫瘤顯示出明顯更高的circITGB6表達，而其他9種circRNA則沒有（圖1b）。作者還檢測OC組織和正常卵巢上皮組織中的circITGB6水平，結果顯示OC組織中的circITGB6水平明顯高于正常組織(補充圖1B)。值得注意的是，與CDDP敏感的OC患者和正常對照相比，CDDP耐藥OC患者血清中的circITGB6表達水平顯著上調（圖1c）。此外，與腫瘤circITGB6低表達的患者相比，CDDP顯著上調腫瘤circITGB6水平的OC患者總體生存期相對較低，復發率較高。因此，circITGB6的高表達可能是一個預后因素(圖1D、E)。隨后，作者對circITGB6的結構進行了表征，發現它是由整合素亞基β 6 (ITGB6)的外顯子10和11的反剪接形成的(圖1F)。如圖1G所示，circITGB6擴增產物僅在cDNA中通過發散引物檢測到;沒有從基因組DNA (gDNA)中擴增產物(圖1G)。高穩定性是circRNA的一個關鍵特征因此，為了驗證circRNA的穩定性，作者使用RNase R外切酶對RNA進行預處理。結果表明，環狀ITGB6對RNase R具有抗性，而線狀ITGB6 RNA經RNase R處理后降解明顯(圖1H)。此外，circITGB6的半衰期明顯長于線性ITGB6 mRNA(圖1I,J)。然后，作者進行細胞核和細胞質RNA提取和FISH檢測，circITGB6主要定位于OC細胞的細胞質中(圖1K, L)。

圖1 circITGB6水平升高與卵巢癌化療耐藥和預后不良相關

2.circITGB6誘導的OC體內化學耐藥是依賴性的

       鑒于circITGB6在OC CDDP耐藥中的重要臨床相關性，作者探索circITGB6在這一過程中的體內功能作用。CircITGB6通過circITGB6過表達質粒成功上調，轉染sh-circITGB6后表達下調，靶向circITGB6的反剪接區。為評估circITGB6在OC中的功能，將熒光素酶標記的circITGB6過表達或低表達的ID8細胞腹腔注射到雌性C57BL/6小鼠中。CDDP處理后，circ ITGB6過表達組小鼠熒光素酶信號明顯強于對照組，出血性腹水明顯增多;相比之下，作者檢測到sh-circITGB6組的熒光素酶活性明顯低于對照組，出血性腹水較少(圖2A-C)。此外，在CDDP處理下，circITGB6過表達組小鼠的生存時間短于vector control組小鼠，circ ITGB6沉默細胞小鼠的生存時間長于control組小鼠(圖2D)。免疫組化(IHC)結果顯示，在CDDP處理下，隨著circITGB6上調(通過原位雜交(ISH)評估)，KI-67+癌細胞數量顯著增加，TUNEL+ (TdT介導的dUTP Nick End Labeling)細胞數量顯著減少(圖2E-H)。然而，circITGB6是否通過與宿主免疫系統相互作用調動了其他抗腫瘤機制來發揮其抗腫瘤作用尚不清楚。有趣的是，在嚴重免疫缺陷的NCG小鼠中，作者發現CDDP對ID8 OC細胞的抗腫瘤作用喪失(圖2I-K)。此外，作者進行了一系列體外研究，發現與對照細胞相比，circ ITGB6過表達細胞和circ ITGB6敲低細胞在CDDP處理下，CDDP的半最大抑制濃度(IC50)和集落形成能力都沒有顯著變化(圖2L、M)。此外，作者發現，與單一培養的對照細胞相比，circ ITGB6過表達或circ ITGB6沉默的細胞中CDDP誘導的凋亡沒有明顯減少或增加(圖2N,O)。

圖2 circITGB6誘導的OC體內化療耐藥是依賴性的

3.circITGB6誘導巨噬細胞向M2表型極化

       由于這一發現與C57BL/6小鼠中circ ITGB6誘導的CDDP耐藥不一致，作者進一步探討了OC中是否有其他關鍵因素導致CDDP耐藥。癌癥免疫學的最近的新進展表明，癌癥的治療耐藥性也在很大程度上取決于癌細胞與TME的其他浸潤細胞組分(特別是免疫細胞)之間的串擾介導的外在機制。為了探索circITGB6表達調節腫瘤組織中浸潤性免疫細胞與癌細胞相互作用的可能性，作者進行了基于bulk RNA-seq的細胞富集分析(xCell)。有趣的是，在不同類型的浸潤性免疫細胞中，巨噬細胞與circITGB6表達呈顯著正相關(圖3A)。此外，最近的研究報道，TAM是OC TME中占優勢的浸潤免疫細胞群，它們不僅促進腫瘤血管生成和轉移，而且誘導化療耐藥和抑制抗腫瘤免疫反應。具有M2表型的巨噬細胞具有內在的促腫瘤作用。作者發現巨噬細胞耗竭破壞了CDDP對ID8 OC生長的抗腫瘤作用(圖3B)。
       此外，進一步確定了circITGB6在其他基質細胞(包括CD8+ T細胞和Treg細胞)中的潛在作用。這些結果表明circITGB6起源于OC細胞而不是基質免疫細胞。重要的是，與鉑敏感的OC患者相比，鉑耐藥患者的M2型巨噬細胞明顯增加，但TCGA數據中M1型和M0型巨噬細胞無差異(圖3C-E)。臨床意義與此一致的是，ISH顯示circITGB6在CDDP耐藥OC標本中與CDDP敏感標本相比顯著上調(圖3F、G)。值得注意的是，CD206染色顯示，在circITGB6高表達的OC組織中，浸潤的M2巨噬細胞(CD206+巨噬細胞)數量顯著增加(圖3F - h)。此外，相關分析表明，CDDP應答狀態和circITGB6高表達與OC中CD206+巨噬細胞浸潤呈正相關(圖3I、J)。因此，這些結果表明，circITGB6上調可能通過將TAM極化向M2表型重置而促進OC中CDDP抗性。接下來，作者研究了單核細胞能否通過條件培養基(CM)從穩定轉染circITGB6、sh-circITGB6#1或對照細胞的CM的OVCAR3細胞中分化成M2型巨噬細胞(圖3K)。熒光活化細胞分選分析(FACS)顯示，白細胞間素(IL)4處理組CD206+巨噬細胞百分比高于未處理組，而HLADR+巨噬細胞主要在干擾素γ (IFN-γ)和脂多糖(LPS)處理后誘導(圖3L,M)。用circ ITGB6過表達OVCAR3細胞的CM處理巨噬細胞，與對照組的CM相比，可誘導更多的CD206+巨噬細胞和更少的HLA-DR+巨噬細胞(圖3N,O)。此外，作者收集了OC患者的血清，包括6例高circITGB6表達的OC患者和6例低circITGB6表達的OC患者，他們的OC組織進行了ISH評估。作者用血清處理從健康女性供體獲得的外周血單核細胞(PBMC)來源的單核細胞(圖3P)。與低circITGB6-OC患者源性血清相比，高circITGB6-OC患者源性血清誘導CD206+巨噬細胞百分比更高，HLA-DR+巨噬細胞百分比更低(圖3Q-T)。因此，來自circITGB6高表達或低表達患者的血清中的因子誘導的巨噬細胞極化與來自circITGB6高表達或低表達OC細胞的CM誘導的巨噬細胞極化相似。接下來，作者在體內進一步研究了腫瘤來源的circITGB6對M2巨噬細胞極化的影響，發現腫瘤組織中較高水平的circITGB6伴隨著F4/80+ CD206+ TAMs (M2)的較高浸潤和F4/80+ CD80+ TAMs (M1)的較低浸潤(圖4O,P)。

圖3 CircITGB6誘導巨噬細胞向M2表型極化

4.TAMs (M2表型)在circ ITGB6調控的OC CDDP抗性中的重要作用

       為了評估m2型巨噬細胞的存在如何在功能上教育OC細胞誘導化療耐藥，作者用雙條件培養基(DCM)處理細胞(圖4A)。原代人PBMC來源的CD14+單核細胞從健康供體中分離出來進行進一步探索。首先用穩定轉染circ ITGB6載體、sh-circITGB6#1或sh-circITGB6#2的OC細胞衍生的CM刺激原代人巨噬細胞24小時，然后在新鮮培養基中孵育24小時(DCM)。然后使用該DCM用CDDP處理親代OC細胞進行進一步的體外檢測。與對照OVCAR3/CAOV3細胞相比，sh-circITGB6#1或sh-circITGB6#2 OVCAR3/CAOV3細胞DCM處理親本OC細胞中CDDP的IC50值顯著降低(圖4B,C)。此外，在CDDP給藥的親代OC細胞中，與對照細胞源性DCM孵育相比，在circITGB6沉默的OC細胞衍生的DCM孵育中，CDDP誘導的凋亡死亡和集落形成受損明顯更大(圖4d - 1)。CDDP DNA加合物的形成和持續對CDDP誘導的癌細胞死亡至關重要。與從circITGB6對照細胞中獲得的DCM處理的細胞相比，circITGB6沉默的OVCAR3/CAOV3 DCM處理的親本OC細胞中CDDP誘導的γ-H2AX灶的數量顯著增加(圖4J,K)。此外，在與circ ITGB6沉默OC細胞衍生的DCM孵育的親代OC細胞中，ABCB1和ABCG2等化學耐藥相關基因的表達急劇下降，而cleaved caspase 3和聚adp核糖聚合酶(PARP)的表達急劇增加(圖4L)。此外，作者在骨髓源性巨噬細胞和OC細胞共培養系統中發現了一致的結果(圖4M,N)。癌細胞中藥物積累的減少被認為是促進CDDP耐藥的主要機制。

圖4 TAMs (M2表型)在circitgb6調控的OC CDDP抗性中的重要作用。

5.circITGB6直接與IGF2BP2相互作用

       為了研究circITGB6誘導TAM M2極化的潛在機制，作者使用生物素化circITGB6和對照探針作為陰性對照，進行了RNA拉下實驗，然后進行了質譜(MS)分析，以篩選circITGB6相互作用蛋白(圖5A - C)。作者發現IGF2BP2是一種可能直接與circITGB6結合的蛋白，據報道對調節mRNA穩定性至關重要(圖5A和C)。RIP實驗證實circITGB6和IGF2BP2之間存在相互作用(圖5D)。作者使用免疫熒光-熒光原位雜交(IF-FISH)檢測circITGB6和IGF2BP2的亞細胞定位，IF-FISH圖像顯示circITGB6和IGF2BP2在細胞質中共定位(圖5E)。這些數據表明circITGB6/IGF2BP2在細胞質中形成RNA -蛋白復合物。此外，作者探索了IGF2BP2的哪個結構域促進了與circITGB6的相互作用。使用具有KH結構域截斷的IGF2BP2突變體。RIP實驗顯示IGF2BP2的KH1-2雙結構域特異性結合circITGB6，表明KH1-2雙結構域是與circITGB6相互作用所必需的(圖5F,G)。先前的研究報道，序列CAUH (H=A, C或U)是IGF2BP2僅有的共識識別基序。根據這些結果，通過瀏覽circITGB6的外顯子10-外顯子11連接序列，作者發現位于該序列中的CAUC基序是IGF2BP2的推定結合基序(圖5H，頂部)。此外，通過電泳遷移率轉移，作者證實circITGB6連接處的CAUC基序對于IGF2BP2相互作用至關重要。Super-shift實驗表明IGF2BP2特異性結合該基序。當CAUC基序發生突變時，circITGB6/ IGF2BP2復合物的形成顯著減少(圖5H，底部)。這些數據表明IGF2BP2通過KH1-2雙結構域與circITGB6的CAUC基序結合。

圖5 CircITGB6直接與IGF2BP2相互作用。

6.circITGB6/IGF2BP2/FGF9 RNA -蛋白三元復合物穩定FGF9 mRNA

       正如之前的研究報道的那樣，IGF2BP2在調節mRNA穩定性方面起著關鍵作用。因此，作者對OVCAR3細胞(sh-NC和sh-circITGB6)進行了RNA-seq分析。與sh-NC OVCAR3細胞相比，sh-circITGB6 OVCAR3細胞中86種mRNA的表達明顯降低(log2 |FC|> 1.5)。此外，作者還分析了sh-NC OVCAR3細胞與sh-circITGB6 OVCAR3細胞中下調的mRNA，這些mRNA在化療耐藥OC組織與化療敏感OC組織中同時上調(見圖1A)。之前的研究也報道了IGF2BP2優先結合到下游靶mRNA的3 ' UTR上。因此，作者使用RNA相互作用組百科全書StarBase中不同類型癌癥的RBP CLIP-seq數據集，在上述上調的mRNA中篩選了IGF2BP2下游靶mRNA的3 ' UTR。通過以上篩選方法，作者鑒定出8個IGF2BP2結合的mRNA。考慮到circITGB6誘導TAM M2極化，根據前人的研究，只有一個TAM M2極化相關的分泌因子FGF9被確定為circITGB6的潛在下游靶點(圖5I)。此外，通過qRT-PCR和ELISA檢測證實FGF9是circITGB6的靶標(圖5J-L)。作者還發現沉默circITGB6顯著降低了FGF9 mRNA的穩定性(圖5M)，從而顯著降低了FGF9的表達(圖5N)。通過序列BLAST分析，作者發現circITGB6內部的兩個CAAAC位點可以直接結合到富含AU元素的FGF9的3'UTR (GUUUG基序)(圖6A)。接下來，作者利用一系列體外試驗研究了circITGB6和FGF9 mRNA的相互作用，并通過circRNA下拉試驗確認了相互作用(圖6B)。接下來，作者探索了circITGB6/FGF9 mRNA復合物是否對維持FGF9 mRNA穩定性至關重要。此外，在circITGB6沉默細胞中，FGF9 mRNA的半衰期縮短，而在circITGB6過表達細胞(WT)中延長(圖6C,D)。此外，與circITGB6過表達細胞(WT)相比，當circITGB6的結合位點1或2發生突變時，FGF9 mRNA的半衰期顯著縮短。然而，當circITGB6中的結合位點1和2發生突變時，在circITGB6過表達細胞(Mut1+2)和對照細胞之間，FGF9 mRNA的半衰期無統計學差異(圖6D)。當circITGB6被敲低時，IGF2BP2/FGF9 RNA -蛋白復合物的共定位顯著降低，而IGF2BP2表達無變化(圖6e)。RIP實驗表明，IGF2BP2的KH1-2雙結構域對其與circITGB6和FGF9的相互作用至關重要(圖5G和6F)。此外，通過RIP實驗檢測到，沉默circITGB6顯著降低了FGF9/IGF2BP2 RNA -蛋白相互作用，而上調circITGB6顯著增加了IGF2BP2免疫沉淀部分中FGF9的富集(圖6G)。此外，作者進一步觀察到，敲低IGF2BP2后，FGF9的mRNA穩定性顯著降低(圖6H)。這些數據表明，circITGB6在促進IGF2BP2和FGF9之間的相互作用中起關鍵作用，并通過形成circITGB6/IGF2BP2/FGF9 RNA -蛋白質三元復合物來增加FGF9的mRNA穩定性。

7.FGF9是circ ITGB6誘導的CDDP抗性和M2巨噬細胞極化所必需的

       為了進一步確定FGF9對于circ ITGB6介導的tam M2極化和隨后誘導CDDP抗性是否必不可少，作者在共培養系統中加入了FGF9中和抗體。從OC細胞(轉染載體或轉染circ ITGB6)中收集的上清液用于處理pbmc衍生的CD14+單核細胞。阻斷FGF9可協同消除FGF9促進M2巨噬細胞極化的作用，導致M1巨噬細胞大量出現，M2巨噬細胞較少(圖6I-L)。由于目前缺乏適合體內實驗的FGF9中和抗體，作者在ID8-circITGB6細胞中使用CRISPR/ cas9介導的基因敲除(KO)靶向FGF9進行進一步的體內實驗。作者首先構建了FGF9-KO-ID8circITGB6細胞(圖6M)。結果表明，與體內對照細胞相比，ID8-circITGB6細胞在FGF9 KO后，circITGB6對CDDP抗性的影響明顯減弱(圖6N,O)，存活時間延長(圖6P)。這些發現表明，circ ITGB6介導的TAM M2極化和隨后誘導的CDDP抗性依賴于OC TME中FGF9的分泌。

圖6 circITGB6/IGF2BP2/FGF9 RNA -蛋白三元復合物穩定FGF9 mRNA。

8.靶向腫瘤來源的circITGB6可增強OC的治療效果

       鑒于circITGB6促進TAM M2極化，導致免疫抑制微環境，然后導致CDDP耐藥，作者推斷OC細胞來源的circITGB6可能是一個治療靶點。如圖7A-D所示，與CDDP和磷酸緩沖鹽水(PBS)給藥組相比，CDDP和ASOcircITGB6聯合治療顯著抑制腫瘤生長，提高總生存率。此外，聯合治療小鼠腫瘤中浸潤的CD206+ M2巨噬細胞和FGF9表達顯著降低(圖7E-G)。此外，通過ELISA(圖7I,J)和qRT-PCR(圖7K-M)檢測，注射ASO-circITGB6小鼠腫瘤分離的tam中M2標記物IL-10和Arg1的表達顯著降低，而M1標記物TNF-α和iNOS的表達顯著升高。

圖7 巨噬細胞參與卵巢癌化療耐藥的機制

9.OC中circITGB6/FGF9/M2巨噬細胞極化軸的臨床意義

       IHC和ISH檢測顯示，化療耐藥OC組織中FGF9和circITGB6的表達以及CD206+巨噬細胞的比例明顯高于化療敏感OC組織(圖7N,O)。相關分析顯示，高水平的circITGB6與高水平的FGF9表達和高比例的CD206+巨噬細胞顯著相關(圖70,P)。此外，在OC患者中，CD206+巨噬細胞的比例與FGF9的表達呈正相關(圖7R)。此外，Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗顯示，circITGB6高表達、FGF9高表達、CD206+巨噬細胞浸潤比例高的OC患者無復發生存期最短(圖7S)。綜上所述，作者的研究結果表明circITGB6/IGF2BP2/FGF9形成一種RNA -蛋白復合物來穩定FGF9，誘導巨噬細胞向M2表型極化，然后導致人類OC中CDDP耐藥、惡性進展和不良臨床結果(圖7T)。
結論
       總之，作者發現了一個涉及circITGB6/IGF2BP2/FGF9軸的新型細胞串擾臨床網絡，該網絡可以調節巨噬細胞m2型極化、OC CDDP抗性和OC預后。作者的研究也提供了針對巨噬細胞在OC TME中的潛在治療策略。

實驗方法
患者樣本收集，q-PCR，WB，IHC，FISH，質粒構建，RNA干擾，細胞轉染，CRISPR/Cas9，集落形成實驗，TUNEL實驗，流式細胞術，ELISA，IF染色，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡實驗，雙熒光素酶報告基因檢測，RNA測序，pull-down，RNA免疫沉淀實驗，EMSA
參考文獻
Li H, Luo F, Jiang X, Zhang W, Xiang T, Pan Q, Cai L, Zhao J, Weng D, Li Y, Dai Y, Sun F, Yang C, Huang Y, Yang J, Tang Y, Han Y, He M, Zhang Y, Song L, Xia JC. CircITGB6 promotes ovarian cancer cisplatin resistance by resetting tumor-associated macrophage polarization toward the M2 phenotype. J Immunother Cancer. 2022 Mar;10(3):e004029. doi: 10.1136/jitc-2021-004029. PMID: 35277458; PMCID: PMC8919471.