實驗方法：RT?qPCR，細胞增殖和集落形成分析，異種移植研究，傷口愈合，transwell，RNA pulldown，RNA?IP，Western blot，泛素化分析。

       胃癌仍然是世界上癌癥死亡的主要原因。從全基因組關聯研究鑒定的胃癌風險位點轉錄的lncRNAs是癌癥發生和疾病進展的關鍵模式。然而，lncRNA在大多數癌癥風險位點的生物學意義仍然知之甚少。在本研究中，我們發現了來自6p22.1胃癌風險位點的LINC00240，它是一種新的致癌基因。胃癌標本中LINC00240的表達明顯高于正常組織，其高表達水平與患者生存率差相關。LINC00240在體外和體內均能促進胃癌細胞的惡性增殖、遷移和轉移。重要的是，LINC00240可以通過其新型去泛素化酶USP10消除癌蛋白DDX21的泛素化，穩定DDX21，從而促進胃癌的進展。綜上所述，我們的數據揭示了lncRNAs如何通過加強靶蛋白與其去泛素酶之間的相互作用來控制蛋白去泛素化的新范例。這些發現突出了lncRNA作為創新治療靶點的潛力，從而為臨床轉化奠定了基礎。本文于2023年4月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術路線

結果：
1）胃癌組織中LINC00240表達升高與患者生存時間縮短相關
       為了檢驗染色體6p22.1風險位點轉錄的lncRNA是否促進胃癌的發展，我們首先在Discovery隊列配對的胃癌標本和正常組織中測定了三種候選lncRNA (LINC00240、LINC01012和ZNRD1AS1)的水平(圖1A)。我們發現只有LINC00240在惡性組織中較正常胃標本表達明顯升高(圖1A)。我們發現驗證隊列胃癌標本中LINC00240水平顯著升高(圖1B)。為了支持這一觀點，與中國另一個胃癌隊列(GSE54129)的正常組織相比，癌標本中LINC00240表達顯著升高。與早期疾病患者相比，晚期疾病患者中LINC00240的表達顯著升高(圖1D和E)。重要的是，LINC00240水平與無進展生存期(PFS)和患者的總生存期(OS) 顯著相關(圖1F和G)。與LINC00240高表達的患者相比，LINC00240低表達的患者PFS或OS時間延長(圖1F和G)，提示LINC00240可能作為一種新型癌基因參與了胃癌的進展。

2）LINC00240在體外和體內對胃癌細胞的惡性增殖有促進作用
       接下來，我們在體外和體內研究了LINC00240在胃癌發展中的作用。在穩定表達LINC00240 shRNAs的HGC-27和MGC80-3細胞中，lncRNA的表達顯著降低 (圖2A)。在穩定表達LINC00240結構的HGC-27和MGC80-3細胞中，發現LINC00240顯著過表達 (圖2B)。如圖2C和2D所示，沉默LINC00240可顯著抑制HGC-27和MGC80-3細胞的增殖；而異位表達LINC00240可顯著提高胃癌細胞活力。同樣，下調LINC00240的表達抑制了HGC-27和MGC80-3細胞的克隆形成 (圖2E)。過表達LINC00240的胃癌細胞克隆原性增強(圖2F)。此外，沉默LINC00240可顯著促進胃癌細胞凋亡(圖2G)。總之，這些數據闡明了LINC00240在胃癌中的致癌功能。然后，我們通過胃癌異種移植評估了LINC00240在體內的作用。與對照組相比，穩定沉默LINC00240明顯抑制胃癌異種移植物的生長(圖2H-J)。相反，穩定過表達LINC00240的異種移植物生長速度更快，腫瘤體積和腫瘤重量明顯高于對照異種移植物 (圖2K-M)。綜上所述，這些結果表明LINC00240在體內能夠促進胃癌的惡性增殖。

3）LINC00240提高胃癌細胞侵襲活性
       接下來，我們研究了LINC00240是否會影響胃癌細胞的遷移和侵襲。我們進行了傷口愈合實驗，以確定LINC00240對胃癌細胞遷移的影響。穩定的LINC00240-KD顯著損害胃癌HGC-27細胞的運動能力，而穩定的LINC00240-OE則加速胃癌HGC-27細胞的遷移能力。與此觀察結果一致，沉默LINC00240明顯減弱了胃癌MGC80-3細胞的遷移，強制表達的LINC00240促進了MGC80-3細胞的運動能力(圖3A)。侵襲實驗表明，穩定沉默的LINC00240可以減少胃癌細胞的侵襲。相反，異位表達LINC00240后，胃癌細胞的侵襲能力增強(圖3B)。然后，我們在體內研究了LINC00240是否可以調節胃癌細胞的轉移。我們發現，LINC00240缺失抑制胃癌細胞的肺轉移；而穩定過表達的LINC00240明顯促進了胃癌肺轉移(圖3C)。HE染色和vimentin免疫組化進一步證實了LINC00240在體內對胃癌細胞轉移的影響(圖3D和E)，這些結果表明LINC00240增強了胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

4）LINC00240在胃癌細胞中與癌蛋白DDX21相互作用
       為了探究LINC00240在胃腫瘤發生中的作用，我們首先檢測了LINC00240在胃癌細胞中的細胞定位。有趣的是，我們發現LINC00240主要位于胃癌細胞的細胞核中(圖4A)。為了測試LINC00240是否與胃癌中的某些蛋白質相互作用，我們對由LINC00240拉下的MGC80-3細胞提取物進行了RNA拉下試驗和質譜蛋白質組學。在LINC00240下拉的蛋白中，我們通過獨立的RNA下拉和WB成功驗證了DDX21是lncRNA的結合蛋白(圖4B)。RIP實驗表明，與IgG對照相比，兩種胃癌細胞系中抗DDX21抗體沉淀的RNA-蛋白復合物中LINC00240明顯富集 (圖4C)。為了探索LINC00240與DDX21相互作用所需的特定區域或結構域，我們構建了各種截斷的DDX21構建體和截斷的LINC00240質粒(圖4D和E)。結果表明，DDX21蛋白的GUCT基序(aa 617-709)和LINC00240 RNA的中間區域(核苷酸357-674)是LINC00240與蛋白質相互作用需要的(圖4D和E)。與正常組織相比，胃癌組織中DDX21的表達也顯著升高 (圖4F)。DDX21的異常高表達與胃癌患者的OS或PFS差相關 (圖4G和H)。沉默DDX21可顯著抑制HGC-27或MGC80-3細胞的活力(圖4I-K)，表明DDX21在胃癌中的致癌性質。綜上所述，這些發現表明，在胃癌細胞中，LINC00240可以通過GUCT基序與癌蛋白DDX21相互作用。

5）LINC00240通過泛素-蛋白酶體途徑抑制DDX21的降解
       有趣的是，沉默LINC00240明顯抑制了DDX21蛋白在胃癌細胞中的表達(圖5A)。相反，過表達的LINC00240在HGC27或MGC80-3細胞中顯著上調DDX21蛋白水平(圖5B)。與對照組相比，用MG132處理穩定的LINC00240-KD胃癌細胞增加了內源性DDX21蛋白的表達(圖5C和D)。MG132消除了LINC00240誘導的HGC-27或MGC80-3細胞中DDX21蛋白的上調(圖5E和F)，表明lncRNA可能參與調節DDX21的蛋白酶體降解。為了驗證這一點，我們接下來用蛋白質合成抑制劑CHX處理了HGC-27或MGC80-3細胞，檢測了DDX21的表達。結果發現，穩定的LINC00240-KD細胞中DDX21蛋白水平的下降速度遠快于對照細胞(圖5G)。相反，用CHX處理穩定的LINC00240-OE胃癌細胞導致DDX21蛋白的半衰期明顯長于對照細胞(圖5H)。我們隨后探索了依賴LINC00240的DDX21的降解是否通過其泛素化介導。與對照細胞相比，在穩定的LINC00240-KD細胞中檢測到DDX21蛋白的泛素信號顯著增加(圖5I)。與對照細胞相比，穩定的LINC00240-OE細胞中DDX21的泛素化明顯降低(圖5I)。拯救實驗表明，沉默DDX21可顯著抑制穩定過表達LINC00240的胃癌細胞的增殖(圖5J)。相反，過表達DDX21可增強穩定敲低LINC00240的胃癌細胞的增殖(圖5K)。這些結果表明LINC00240通過泛素-蛋白酶體系統穩定DDX21蛋白。

6）LINC00240阻斷DDX21與其新型去泛素酶USP10的結合
       為了揭示LINC00240如何延緩DDX21的泛素蛋白酶體降解，我們分析了MGC80-3細胞中LINC00240下拉的蛋白。質譜分析結果表明，該樣品中只有一種去泛素酶USP10。為了確認USP10是否是DDX21的一種新型去泛素酶，我們首先檢測了USP10沉默表達的HGC-27或MGC80-3細胞中DDX21的水平(圖A)。在敲除USP10表達后，與對照細胞相比，胃癌細胞中DDX21蛋白水平明顯降低(圖6A)。Co-IP實驗顯示，內源性USP10可以在HGC-27或MGC80-3細胞中被DDX21沉淀(圖6B)。在兩種胃癌細胞系中，內源性DDX21也可以被USP10沉淀(圖6C)。接下來，我們研究了LINC00240是否影響細胞中DDX21和USP10之間的相互作用。與對照細胞相比，穩定的LINC00240-KD細胞中DDX21沉淀的USP10蛋白較少(圖6D和E)，而穩定的LINC00240-OE細胞中DDX21沉淀的USP10蛋白較多(圖6D和G)。綜上所述，這些發現表明，LINC00240通過增強DDX21與其新型去泛素酶USP10的相互作用來促進DDX21的穩定(圖6H)。

結論：我們揭示了從6p22.1位點轉錄的LINC00240在胃癌中的重要性，并發現了LINC00240和USP10之間在控制致癌蛋白DDX21泛素化中的一種新的調控伙伴關系。LINC00240-USP10-DDX21軸可能成為臨床上胃癌的潛在治療靶點。
參考文獻：Zhang N, Wang B, Ma C, Zeng J, Wang T, Han L, Yang M. LINC00240 in the 6p22.1 risk locus promotes gastric cancer progression through USP10-mediated DDX21 stabilization. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Apr 18;42(1):89. doi: 10.1186/s13046-023-02654-9.