實驗方法：免疫組織化學（IHC），免疫熒光（IF），流式細胞術，生物信息學分析，RNA測序，細胞因子陣列，蛋白質印跡，熒光素酶報告基因，染色質免疫沉淀測定，DNA pulldown、免疫共沉淀，動物實驗

骨是晚期前列腺癌（Pca）最常見的遠處轉移部位。在骨腫瘤微環境（TME）中，獨特的骨髓微環境和髓系細胞參與了骨腫瘤的轉移、定植、休眠、激活和免疫逃逸。在過去的幾十年中，晚期Pca的診斷率從3.9%增加到8.2% ，高達90%的晚期Pca患者發生骨轉移。晚期PCa的治療措施有限，包括雄激素剝奪治療、生物靶向治療和骨靶向藥物治療，且PCa最終會發生骨轉移進展，成為一種致死性疾病。免疫檢查點治療（ICT）已被證明對多種實體腫瘤有效。然而，骨轉移性PCa傳統上被認為是“免疫沙漠”，導致ICT應答不佳。BHLHE22是堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子超家族的成員，其峰值表達與晚期PCa細胞的轉化進展相關。然而腫瘤BHLHE22在Pca骨轉移中的作用尚不清楚。

技術路線：

主要研究結果：

1. BHLHE22在前列腺癌骨轉移組織中表達上調，在轉移骨組織中進一步升高

通過免疫組織化學染色檢測BHLHE22在222例PCa組織中的表達，探討其在PCa轉移中的潛在作用。作者發現，與無骨轉移的原發性PCa（PCa/nBM）相比，BHLHE22在有骨轉移的原發性PCa（PCa/BM）中的表達顯著增加，并且在BM組織中進一步上調（圖1A）。然后，作者分析了人類PCa表達譜GSE77930，發現與原發性PCa和其他內臟轉移部位相比，BHLHE22在轉移性骨組織中的表達顯著上調（圖1B）。基于癌癥基因組圖譜（TCGA-PRAD）數據集的進一步分析表明，與PCa/nBM相比，BHLHE22在PCa/BM中的表達顯著增加（圖1C）。此外，基于TCGA-PRAD的Kaplan-Meier分析表明，BHLHE22高表達預測較短的無病生存期（圖1D）。一致地，BHLHE22表達上調預示著較差的臨床病理特征和較短的總生存期和無BM生存期（圖1E, F）。總之，這些結果表明，BHLHE22的高表達與PCa患者的BM和不良預后相關。

圖1 BHLHE22在前列腺癌骨轉移中表達上調，并促進骨轉移

2. BHLHE22通過免疫相關的方式促進BM

為了探討BHLHE22在前列腺癌中的生物學功能，作者通過左心室注射熒光素酶標記的前列腺癌細胞構建了BM小鼠模型。采用生物發光成像活體監測骨轉移。RM-1細胞BHLHE 22過表達顯著促進同基因C57BL/6J小鼠的腫瘤BM（圖1G）。然后，通過HE證實了BM，并通過micro-CT掃描對溶骨性病變進行定量（圖1H）。Micro-CT分析表明，BHLHE22導致了更大的溶骨性骨病區（圖1J, K）。生存分析表明，BHLHE22的過表達預測了更短的總生存期和無BM生存期（圖1L, M）。綜上所述，在免疫正常和免疫缺陷小鼠之間，BHLHE22驅動不同的骨髓表型。在體內和體外實驗中，BHLHE22引起了一致的表型差異。因此，作者假設BHLHE22對骨髓狀態的不同影響可能是由于其對腫瘤骨免疫微環境的影響所致。

3. BHLHE22驅動骨髓中的免疫抑制性TME

為了確定BHLHE22是否以及如何影響PCa骨免疫微環境，作者研究了PCa標本中免疫抑制髓系細胞和CD8 T細胞的浸潤。免疫抑制髓系細胞定義為人組織樣本中的CD33細胞20免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞被定義為CD11bGr1細胞，可進一步分為CD11bLy6CloLy6G(中性粒細胞)和CD11bLy6ChiLy6G-(單核細胞)對PCa/BM和BM組織進行CD33、CD8、BHLHE22的組織免疫熒光和4 '，6-二脒基-2-苯基吲哚染色（圖2A, B），結果提示在PCa/BM和BM組織中BHLHE22-high組比BHLHE22-low組有更多的CD33細胞浸潤。BHLHE22-low組的CD8 T細胞浸潤高于BHLHE22-high組（圖2D, E）。然后，作者在LCV注射RM-1-BHLHE22和RM-1-Vector細胞的C57BL/6J小鼠骨髓樣本中檢測了腫瘤浸潤的CD11bGr-1細胞，以及CD4 T和CD8 T細胞。RM-1-BHLHE22組骨髓中CD11bGr-1細胞浸潤較RM-1-Vector組明顯增加，CD4 T和CD8 T細胞浸潤較RM-1-Vector組明顯減少（圖2C, F）。

為了進一步證實BHLHE22在骨TME中的作用，作者收集了同時注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞的C57BL/6J小鼠的骨髓樣本，并使用流式細胞術進行免疫分析。作者評估了CD11bGr-1細胞在CD457AAD -細胞中的相對比例。與RM-1-Vector組相比，RM-1-BHLHE22組的CD11bGr-1細胞浸潤顯著增加，尤其是單核細胞，而CD4 T和CD8 T細胞浸潤顯著減少（圖2G-J）。進一步研究與免疫功能相關的關鍵因子，包括Arg-1、IFN-γ和PD-1。RM-1-BHLHE22組的Arg-1Gr-1細胞（圖2G, H）和PD-1CD8 T細胞比例較高，而IFN-γCD8 T細胞比例較低（圖2I, K）。此外，為了檢測這些CD11bGr-1細胞是否確實是有功能的免疫抑制髓系細胞，作者進行了標準的T細胞共培養增殖抑制試驗。將分離出的CD11bGr-1細胞以不同比例與CD8 T細胞共培養：4天后，CD11bGr-1細胞強烈抑制CD3和CD28抗體誘導的T細胞增殖和活化（圖2L, M）。綜上所述，作者得出結論，BHLHE22-high PCa細胞誘導的CD11bGr-1細胞通過消耗T細胞來驅動免疫抑制的TME 。

圖2 BHLHE22在骨轉移中驅動免疫抑制性腫瘤微環境

4. BHLHE22控制免疫抑制性中性粒細胞

作者分析了RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞的RNA-seq數據集，并分別與vector細胞進行比較。作者確定了103個共上調基因和37個共下調基因。令人驚訝的是，CSF2是RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞中唯一共同上調的分泌因子基因（圖3A）。

細胞因子陣列分析顯示RM-1-BHLHE22細胞比RM-1-Vector細胞分泌更高量的CSF2（圖3B）。Western blot結果顯示RM-1-BHLHE22組中CSF2的表達水平較高（圖3C, D）。在LCV注射的C57BL/6J小鼠骨髓腫瘤樣本中，作者檢測了CSF2的表達與免疫細胞浸潤的關系，包括免疫抑制性髓系細胞（Gr-1, S100A9）、CD4 T和CD8 T細胞。BHLHE22過表達組的Gr-1和S100A9細胞計數較高，CSF2水平高于載體組（圖3E-H）。相關性分析顯示，CSF2表達與Gr-1細胞浸潤呈正相關（圖3h）。Ki-67增殖標志物的陽性染色表明，BHLHE22誘導的腫瘤浸潤CD11bGr-1細胞促進小鼠的骨髓生長（圖3I）。因此，作者假設CSF2可能是BHLHE22 PCa誘導的免疫抑制性骨TME的關鍵介質。

接下來，進行了體內和體外研究，以評估CSF2中和的治療效果。對于體內CD11bGr-1細胞浸潤分析，C57BL/6J小鼠LCV注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞。然后，作者用重組鼠CSF2治療非荷瘤小鼠。用抗CSF2抗體處理LCV注射小鼠。采用BLI監測腦轉移，micro-CT掃描定量分析溶骨性病變。注射后30 d，取骨髓進行流式細胞術分析。與非荷瘤組相似，腫瘤BHLHE22過表達顯著促進了CD11bGr-1細胞的浸潤。然而，抗CSF2抗體顯著抑制CD11bGr-1細胞浸潤（圖3J）。分離CD11bGr-1細胞，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯標記CD11bGr-1細胞進行體外擴增分析。將分離的CD11bGr-1細胞與RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22細胞共培養。未共培養的CD11bGr-1細胞作為溶劑組。然后，作者用重組鼠CSF2處理非共培養的細胞。用抗CSF2抗體處理共培養細胞。孵育5天后，與CSF2組相似，CFSE實驗顯示腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞擴增。然而，抗CSF2抗體顯著抑制了CD11bGr-1細胞的擴增（圖3K）。因此，作者得出結論，CSF2是BHLHE22誘導免疫譜改變的關鍵介質。

圖3 BHLHE22控制免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞的募集，CSF2作為關鍵介質發揮作用

5. BHLHE22和PRMT5形成一個轉錄復合物并轉錄激活CSF2

BHLHE22是一個轉錄因子;因此，作者試圖確定CSF2是否受BHLHE22的轉錄調控。熒光素酶報告基因實驗顯示BHLHE22增加RM-1-BHLHE22和PC-3-BHLHE22細胞中CSF2啟動子的活性（圖4A）。BHLHE22通常形成一個轉錄復合物，在多種組織中決定細胞命運。為了確定潛在的蛋白-蛋白相互作用，作者進行了免疫共沉淀試驗。使用質譜（MS）分析洗脫液和差異豐度條帶。質譜結果確定了10個潛在轉錄輔因子的富集（圖4B）。作者將DNA探針與磁珠偶聯，并使用未偶聯的磁珠作為陰性對照。DNA下拉分析顯示，在CSF2啟動子區域P1和P1-4中，在60和75 kDa之間發現了相同的差異表達條帶，但在P2、P3和P4中沒有（圖4C）。因此，作者認為P1區域可能與BHLHE22結合有關。此外，細胞IF染色也顯示了BHLHE22和PRMT5在細胞核中的共定位（圖4D）。為了進一步驗證BHLHE22是否結合到CSF2啟動子的P1區域來激活基因轉錄，作者構建了3個CSF2熒光素酶啟動子載體：pGL4-FL-BBS（全長BBS）、pGL4-P1-BBS-Wt（野生型P1區域）和pGL4-P1-BBS-Mut（突變BBS）。將其轉染RM-1-BHLHE22細胞和HEK293T細胞。熒光素酶分析表明P1區域的突變顯著降低了CSF2啟動子活性（圖4E）。為了進一步確定BHLHE22和PRMT5之間的相互作用，作者進行了內源性和外源性免疫共沉淀（IP）實驗。值得注意的是，兩種IP檢測均顯示BHLHE22與PRMT5相互作用（圖4F, G）。

接下來，作者研究了轉錄復合體是如何與靶基因結合的，以及轉錄復合體中Bhlh以RM-1-vector、RM-1-BHLHE22和RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh 3種RM-1細胞株為研究對象進行芯片定量PCR（chip-qPCR）。作者發現PRMT5在RM-1-Vector細胞中不能與CSF2啟動子結合。而在RM-1-BHLHE22和RM-1-BHLHE22- PRMT5 -sh細胞中，ChIP-qPCR顯示BHLHE22與CSF2啟動子的結合能力相似。然而，在RM-1-BHLHE22細胞中，PRMT5顯示出與CSF2啟動子的強結合能力（圖4H）。在BHLHE22缺失的情況下，PRMT5不能與CSF2啟動子結合（圖4H）。因此，PRMT5結合CSF2啟動子的能力依賴于BHLHE22。這些結果表明BHLHE22與CSF2啟動子結合并招募PRMT5形成一個轉錄復合物，從而激活CSF2的轉錄。

圖4 BHLHE22和PRMT5形成一個轉錄復合物并轉錄激活CSF2

6. PRMT5表觀遺傳激活CSF2表達

據報道，PRMT5作為一種表觀遺傳修飾因子，通過甲基化組蛋白來調節基因表達。此外，PRMT5通過不同組蛋白的對稱二甲基化在轉錄激活或抑制中發揮作用。在RM-1-BHLHE22細胞中敲低PRMT5后，作者通過蛋白質印跡法和實時定量反轉錄PCR檢測CSF2的表達水平。作者還檢測了各種對稱甲基化組蛋白的水平，如H4R3, H3R2和H3R8。值得注意的是，PRMT5敲低誘導H4R3me2a和H3R2me2s水平降低（圖4I）。既往研究表明，H4R3（H4R3me2a）和H3R2（H3R2me2s）二甲基化在腫瘤中可激活基因轉錄。隨后，為了確定PRMT5是否可以直接甲基化CSF2啟動子區域周圍的H4R3和H3R2，作者在RM-1-BHLHE22細胞中進行了幾次ChIP測定。敲低PRMT5降低了H4R3me2a和H3R2me2s在CSF2啟動子上的富集，支持CSF2啟動子是PRMT5的一個二甲基化靶點的觀點（圖4J）。GSK591顯著降低RM-1-BHLHE22細胞中CSF2啟動子上H4R3me2a和H3R2me2s的富集（圖4K）。

為了評估PRMT5對免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞浸潤的影響，作者進行了體內和體外研究來評估PRMT5抑制劑的治療效果。PRMT5抑制劑GSK3326595用于體內實驗，GSK591用于體外實驗。對于體內CD11bGr-1細胞浸潤分析，C57BL/6J小鼠被LCV注射RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22或RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh細胞。另一組RM-1-BHLHE22用GSK3326595處理。采用BLI監測腦轉移，micro-CT掃描定量分析溶骨性病變。注射后30 d，取小鼠骨髓進行流式細胞術分析。腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞的浸潤。然而，敲低PRMT5和PRMT5抑制劑GSK3326595處理顯著抑制了CD11bGr-1細胞的浸潤（圖4L）。在體外，分離的小鼠CD11bGr-1細胞被CFSE標記，并與RM-1-Vector或RM-1-BHLHE22或RM-1-BHLHE22-PRMT5-sh細胞共培養。另加入GSK591處理RM-1-BHLHE22共培養組。在孵育5天后，CFSE實驗顯示腫瘤BHLHE22過表達顯著促進CD11bGr-1細胞的擴增。然而，敲低PRMT5和PRMT5抑制劑GSK591處理顯著抑制了CD11bGr-1細胞的擴增（圖4M）。綜上所述，這些結果表明PRMT5表觀遺傳激活CSF2的表達，抑制PRMT5可以減少CD11bGr-1細胞的浸潤。

7. CSF2中和和ICT聯合治療在體內有效抑制腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及骨髓

腫瘤內CD4 T細胞的擴增和細胞毒性CD8 T細胞的活化決定了ICT的治療效果。CD11bGr-1細胞驅動的免疫抑制微環境是骨轉移性PCa對ICT反應差的主要原因之一，這促使作者研究是否抑制BHLHE22/PRMT5/CSF2通路可以提高ICT反應。

首先，作者在注射RM-1-BHLHE22細胞的C57BL/6J小鼠模型中驗證了作者的假設。注射后3日，作者開始用抗CSF2和/或抗PD -1抗體治療小鼠（圖5A）。使用BLI監測BM，使用micro-CT掃描和TRAP染色測量BM病灶（圖5B, C）。

70 d時終止實驗，測定BM發生率。在BM發生率方面，單獨抗CSF2或抗PD-1抗體與對照組無顯著差異。然而，在所有組中，抗CSF2和抗PD-1聯合治療抑制BM的發生最有效（圖5D）。盡管如此，與快速進展的對照組相比，單獨使用抗CSF2或抗PD-1抗體治療可減緩腫瘤進展，并縮小BM病變面積；在所有治療組中，聯合治療組最有效地減緩了腫瘤進展，并減少了BM病變面積（圖5E-G）。生存分析表明，聯合治療組顯著延長了總生存期和無BM生存期（圖5H）。

隨后，作者使用流式細胞術進一步檢測了骨髓中免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及T細胞的浸潤（圖5J）。與對照組相比，單獨抗CSF2可減少CD11bGr-1細胞浸潤，增加CD4和CD8 T細胞浸潤，但不能促進IFN-γCD8 T細胞擴增（圖5K-M）。單獨抗PD-1促進IFN-γCD8 T細胞的擴增，但對CD11bGr-1細胞、CD4和CD8 T細胞的浸潤無明顯影響（圖5K-M）。值得注意的是，聯合治療顯著減少了CD11bGr-1細胞的浸潤，增加了CD4和CD8 T細胞的浸潤，并促進了IFN-γCD8 T細胞的擴增（圖5K-M）。綜上所述，這些結果表明，抗CSF2和抗PD-1抗體聯合應用可以通過緩解免疫抑制來有效增強ICT對BHLHE22前列腺癌的治療效果。

圖5 CSF2中和和免疫檢查點治療聯合治療可有效抑制體內腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞以及骨轉移

8. PRMT5抑制劑聯合ICT可有效抑制體內腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞、單核細胞和骨髓

抑制PRMT5可顯著降低CSF2的表達，減輕免疫抑制性骨TME。因此，作者進一步探索PRMT5抑制劑聯合ICT能否提高ICT的療效。注射后3日，作者開始用GSK3326595和/或抗PD-1抗體治療小鼠（圖6A）。通過BLI監測BM，通過micro-CT掃描和TRAP染色測量BM病灶（圖6B, C）。

于70 d時終止實驗。在骨髓發生率方面，單獨GSK3326595治療與對照組無顯著差異。然而，GSK3326595和抗PD-1的聯合治療有效地抑制了BM的發生（圖6D）。與單獨抗PD-1治療相似，單獨GSK3326595治療略微減緩了腫瘤進展，減少了BM病灶面積；聯合治療最有效地減緩了腫瘤進展，減少了BM病灶面積（圖6E-G）。生存分析表明，聯合治療顯著延長了總生存期和無BM生存期（圖6H）。流式細胞術表明，GSK3326595處理減少了CD11bGr-1細胞的浸潤，并增加了CD4和CD8 T細胞的浸潤（圖6J-M）。GSK3326595聯合抗PD-1促進IFN-γCD8 T細胞擴增（圖6J-M）。GSK3326595聯合抗PD-1抗體可通過緩解免疫抑制，有效增強BHLHE22前列腺癌對ICT的應答。

圖6 蛋白精氨酸甲基轉移酶5抑制劑聯合免疫檢查點治療在體內可有效抑制腫瘤浸潤的免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞及骨轉移

9. BHLHE22作為前列腺癌骨轉移ICT聯合治療生物標志物的潛在作用

為了評估BHLHE22/PRMT5/CSF2軸與人骨轉移性PCa中免疫細胞浸潤的潛在相關性，作者使用IHC檢測了作者BM組織中BHLHE22、PRMT5和CSF2的表達水平（圖7A）。有證據表明，PRMT5在PCa中上調，并作為PCa細胞生長的癌基因33PRMT5在骨髓組織中普遍呈陽性表達。顯著地，與BHLHE22-low組相比，BHLHE22-high組的CD33細胞計數較高，每個HPF(400×)的CD4 T和CD8 T細胞浸潤較低，CSF2表達較高（圖7B, C）。Ki-67增殖標志物的陽性染色表明BHLHE22在其獨特的骨TME中促進了BM的生長（圖7D）。此外，相關分析顯示BHLHE22與CD4呈負相關（圖7E）和CD8 T細胞浸潤（圖7F），與CD33細胞浸潤呈正相關（圖7G）和CSF2表達（圖7h）。總之，作者的研究結果揭示了在PCa中由BHLHE22/PRMT5/CSF2通路驅動的具有免疫抑制作用的骨TME和相關骨髓的分子機制（圖7I）。靶向PRMT5/CSF2聯合抗PD-1是BHLHE22前列腺癌患者潛在的治療方法。

圖7 BHLHE22作為免疫檢查點療法聯合治療骨轉移性PCa的生物標志物的潛在作用

結論：

綜上所述，作者闡明了腫瘤BHLHE22在前列腺癌骨轉移中的免疫抑制機制。BHLHE22與PRMT5偶聯形成轉錄復合物，表觀遺傳激活CSF2表達，CSF2是參與免疫抑制性中性粒細胞和單核細胞積累的關鍵抑制性細胞因子。腫瘤BHLHE22是一種很有前景的生物標志物，可用于增強抗PD-1治療的療效。抗CSF2 /抗PRMT5和抗PD-1的聯合治療代表了具有BHLHE22和骨轉移的PCa患者的前瞻性治療。

參考文獻：

Yin C, Wang M, Wang Y, et al. BHLHE22 drives the immunosuppressive bone tumor microenvironment and associated bone metastasis in prostate cancer. J Immunother Cancer. 2023 Mar;11(3):e005532.