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單細胞多組學分析確定了 調節淋巴管平滑肌瘤樣細胞的存活的HOX-PBX基因網絡

欄目:最新研究動態 發布時間:2023-06-30
PBX1調節增加抗凋亡基因的表達,HOX-PBX基因網絡為治療LAM/TSC mTORC1過度活化癌癥提供了有前途的靶點......


淋巴管平滑肌瘤樣病(LAM)是一種罕見的、進展性的肺部疾病,主要影響女性。LAM細胞攜帶TSC1/TSC2突變,導致mTORC1過度活化和細胞無法受控地增殖。mTORC1抑制劑可以穩定肺功能,但持續療效需要長期給藥,而一些患者無法耐受或對治療無響應。雖然 LAM 的遺傳基礎是已知的,但其發病機制仍然不清楚。作者整合了LAM肺部的單細胞RNA測序和單核ATAC-seq,構建了控制LAM細胞轉錄程序的基因調控網絡。作者發現,子宮特異性HOX-PBX轉錄程序在肺部LAMCORE細胞中被激活,作為依賴于HOXD11-PBX1二聚化的細胞存活調節因子。因此,通過HXR9阻斷HOXD11-PBX1二聚化可以抑制LAM細胞在體外和體內的存活。PBX1調節STAT1/3,增加抗凋亡基因的表達,促進LAM細胞在體外的存活。HOX-PBX基因網絡為治療LAM/TSC mTORC1過度活化癌癥提供了有前途的靶點。


技術路線:

 

 

實驗方法:細胞培養、RNA干擾、免疫印跡分析、實時熒光定量PCR、動物模型、細胞毒性實驗、snATAC-seq分析、scRNA-seqsnATAC-seq10x多組數據的生物信息學分析、TRN分析、共焦顯微鏡、免疫熒光染色。

 

1、單細胞基因表達和DNA可及性綜合分析鑒定出LAM中具有子宮選擇性的HOX家族轉錄因子的激活

該研究利用LAM患者肺部樣本的單細胞RNA測序(scRNA-seq)鑒定了一種獨特的細胞群體,稱為LAMCORE,該群體可以與內源性肺細胞類型輕松區分,并且與子宮肌細胞具有最接近的轉錄組相似性。本研究利用10x Multiome、單核測序轉座酶可接近染色質測序(snATAC-seq)和現有的10x scRNA-seq產生的單細胞染色質可及性和基因表達的配對檢測,并對人類LAM組織中的單細胞基因表達和染色質可及性進行了整合分析。使用LungMAP CellRef對整合的LAM單細胞數據進行映射,鑒定出33種不同的細胞類型,包括先前鑒定的LAMCORE細胞群體(1A)。作者發現LAMCORE細胞特異性的ATAC-seq峰值可及性區域在子宮選擇性homeobox轉錄因子的模體中高度富集,包括PBX1PBX3HOXA9HOXA10HOXD11 (1B)

LAMCORE細胞中,HOXD11PBX1MITFTEAD2被預測為具有富集表達的特征基因(圖1C,粉色條),而MYH11ACTA2STAT1STAT3在多種細胞類型中表達,其平均表達水平在LAMCORE細胞中增加(圖1C,藍色條)。在獲取LAMCORE細胞的差異性可及峰集之后,使用Hypergeometric Optimization of Motif EnRichmentHOMER)將峰分配給最近或重疊的基因,從而實現染色質可及性與基因表達的關聯。與LAMCORE細胞選擇性峰相關的最近基因在肌肉結構發育和細胞外基質組織方面功能豐富(圖1D)。

在最近的基因附近,宮頸TFsPBX1PITX2ESR1HAND2)、編碼肌肉和膠原蛋白的基因(ACTA2MYH11COL1A2COL4A1)以及參與凋亡的基因(CRYABPTGISPDE3A)在LAM中表達增加(圖1C)。ATAC測序和RNA表達模式在所有細胞類型中高度一致(圖1E)。作者分析了HOXA10PBX1基因組區域的峰值到基因(P2G)連接(圖1F),并在LAMCORE細胞的HOXA10HOXA11啟動子區域中發現了獨特的可訪問峰,與LAMCORE細胞中HOXA10HOXA11 RNA的選擇性表達一致(圖1F)。PBX1被預測為LAMCORE細胞的標志性基因之一,其基因表達和染色質可訪問峰在其他細胞類型中被檢測到,并且PBX1LAMCORE細胞中的選擇性可能受到其與HOX蛋白的二聚化的影響(圖1F)。因此,目前整合的scRNA-seq/snATAC-seq數據分析確定了子宮特異性轉錄編程(即homeobox轉錄因子家族)在LAMCORE細胞中的表達和活性增加,支持HOX-PBX信號通路激活的理論,在LAMCORE細胞的轉錄和表觀遺傳調控中發揮重要作用。


圖1


2LAM細胞中HOXsPBX1和靶基因的表達顯著。

為了驗證單細胞研究的發現,作者使用逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)測量了5LAM患者和3例非LAM患者組織中PBX1基因表達水平(1)。作者的發現表明,LAM患者肺組織中PBX1 mRNA水平升高(圖2A)。這證實了作者對公開可獲得的PBX1基因表達數據進行分析的結果,這些數據來自激光捕獲的LAM患者肺細胞(n=14GSE12027)與女性癌癥患者肺組織(n=38GSE10072GSE19804)(圖2B)。

已經在肺LAM患者中鑒定出了子宮LAM病變。子宮組織是從一位散發性LAM患者進行子宮切除術時獲取的。LAM子宮的組織病理學顯示多個形態清晰、堅實的結節,具有由肌層形成的卷曲網狀結構,從肌層表面凸出,與平滑肌瘤一致。免疫組化染色顯示ACTA2呈陽性免疫反應。免疫熒光染色顯示PBX1位于ACTA2陽性子宮平滑肌瘤細胞核中(圖2D)。作者已經發表的單細胞RNA測序分析鑒定了三種主要的細胞類型:ACTA2+細胞、免疫細胞和內皮細胞。蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示ACTA2+群體具有明顯的上皮細胞特征(圖2E)。免疫熒光染色顯示PBX1位于ACTA2陽性腎臟脂肪瘤細胞核中(圖2E)。



接下來,作者研究了鼠瘤性硬化2Tsc2)基因缺失大鼠子宮平滑肌瘤來源的ELT3Eker大鼠子宮平滑肌瘤)細胞的異種移植瘤模型中PBX1蛋白水平。在接種后6周,ELT3-V3(表達空載體)和ELT3-T3(表達TSC2)細胞均形成皮下腫瘤。與Tsc2陽性的ELT3-T3細胞相比,Tsc2缺失的ELT3-V3腫瘤細胞中PBX1陽性細胞核的百分比增加(圖2FG)。最后,在肺轉移小鼠模型中,與安慰劑治療相比,PBX1在雌激素誘導的轉移性肺病變中的積累更為突出(圖2H)。與單細胞多組學發現一致,作者的數據證明了LAM組織和TSC2缺陷小鼠腫瘤模型中PBX1表達和PBX1蛋白水平的增加。


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圖2


3PBX1 ChIP-seq LAM 肺部 scRNA-seq 數據的綜合分析,鑒定 HOXSTAT作為PBX1的靶點

PBX1是一種先鋒因子,能夠打開染色質以招募雌激素受體α到乳腺癌細胞中。PBX(PBX1PBX4)HOX(HOX1HOX11)是一類包含homeobox結構域的轉錄因子,它們可以形成功能性二聚體,在不同類型的癌癥中促進增殖、抑制細胞凋亡、誘導血管生成并推動轉移。作者應用乳腺癌PBX1染色質免疫沉淀測序(ChIP-seq)數據集(GSE28008)LAM肺單細胞RNA測序(scRNA-seq)數據集進行整合分析,以在LAMCORE細胞中鑒定潛在的PBX1靶點。具有正向PBX1結合峰和在LAMCORE細胞中選擇性表達的基因包括HOXD11PITX2ESR1NR2F2 (3A)

STAT3被預測為PBX1的轉錄靶點。雖然STAT3LAM和對照組肺細胞中均表達,但其總體表達量在LAM組與對照組肺中存在顯著差異(1C)。具有正向PBX1結合位點和在LAMCORE細胞中選擇性表達的基因在與LAM病理機制相關的通路中發生功能富集,包括LAMCORE細胞中雌激素、ERK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)mTOR信號通路的激活(3B),這支持PBX1參與調控導致LAM發生的基因和通路的概念。雌激素處理增加了ESR1PGR的轉錄水平,但并未影響621-101細胞中PBX1的表達(3C),這表明TSC2缺陷細胞中PBX1表達沒有負反饋調控。


圖3


4PBX1TSC2缺陷細胞中與HOXD11相互作用。

為了確定LAM特異性的HOX/PBX相互作用,作者使用兩種獨立的anti-HOXD11抗體進行免疫共沉淀實驗,檢測來自大鼠子宮平滑肌瘤衍生的ELT3細胞中HOXD11免疫復合物中的PBX1蛋白(圖3D)。共聚焦顯微鏡顯示,在TSC2缺陷細胞的細胞核中,PBX1HOXD11免疫染色共定位(圖3E)。免疫熒光染色顯示,在LAM患者的平滑肌肌動蛋白(ACTA2)陽性肺細胞核中,PBX1HOXD11共定位(圖3F)。

作者構建了一個子宮特異性Tsc2敲除的基因小鼠模型(圖3Ga),并在27周齡時在PRCre;Tsc2f/fTsc2KO)小鼠中識別出子宮增大、囊腫形成和子宮腫瘤的增生(圖3Gb)。組織病理學顯示Tsc2KO小鼠的子宮內膜和肌層細胞(圖3Gc)。免疫印跡分析表明,與野生型(WT)小鼠相比,Tsc2KO小鼠子宮組織中Tsc2蛋白的喪失和S6Ser235/236)磷酸化的增加,這表明mTORC1的激活(圖3Gd)。免疫熒光染色顯示,在LAMPRCre;Tsc2f/f小鼠模型的子宮肌層腫瘤細胞中,PBX1在細胞核中明顯表達,而HOXD11在細胞質周圍的區域豐富表達(圖3Ge)。

綜上所述,作者的研究結果通過綜合基因組分析表明了在TSC2缺陷細胞中PBX1HOXD11之間的相互作用。

 

5HOXD11PBX1LAMCORE細胞中活躍的轉錄調控網絡

為揭示決定LAM特異性細胞命運的基因組和表觀遺傳調控回路,作者利用成對的基因表達和染色質可及性數據(PECA)構建了LAMCORE細胞轉錄調控網絡(TRNs)。PECA是一種統計模型,可以基于基因表達和染色質可及性數據來計算目標基因表達的概率推斷出特定情境下的TRN。為確保TRNLAMCORE特異性的,作者要求轉錄因子(TFs)在LAMCORE細胞中高度表達,并且目標基因與對照間充質細胞相比要么是LAMCORE標志基因,要么是在LAMCORE中誘導的基因。作者確定了在LAMCORETRN中與最多相互作用的TFs節點(網絡的前1%),包括激素受體PGR(孕激素受體)、雄激素受體和Homeobox轉錄因子(HOXA10HOXA11HOXD11PBX1PBX3)(圖4A)。

考慮到作者發現PBX1HOXD11在人類和嚙齒動物的TSC2缺陷細胞中結合(圖3),作者接下來專注于以PBX1-HOXD11為中心的TRN,通過提取直接連接到PBX1HOXD11的基因節點,包括共同的上游調節因子、共同的輔因子和共同的靶基因(圖4B)。共享的PBX1-HOXD11靶基因在功能上富集于肌肉增殖/發育細胞命運承諾傷口愈合激素反應“Wnt信號通路凋亡信號通路重點支持磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-Akt-mTOR信號通路(圖4C)。作者的TRN分析確定了LAMCORE細胞中,以PBX1-HOXD11為中心的TRN上游和下游的精確調控回路,并提供了功能驗證和鑒定PBX1-HOXD11調控LAM病理機制的分子和細胞機制的理論藍圖。

因為STAT家族轉錄因子(STAT1STAT3)是LAMCORE細胞特異染色質可及性區域中高度富集的模體(圖1CD),并且預測它們是PBX1的直接轉錄靶標(圖3A),因此作者構建了PBX1/3STAT1/3共同網絡以確定共享的靶標(圖4D)。由于轉錄因子家族通常共享轉錄因子結合位點和motif,作者將PBX1PBX3組合為PBX家族,將STAT1STAT3組合為STAT家族。 "程序性細胞死亡的調節"PBX / STAT共同靶標基因中最豐富的功能。其中大多數基因與"細胞死亡的負調節"相關(圖4E)。

網絡分析表明,PBXSTAT轉錄因子家族協同作用,抑制LAM細胞凋亡并促進LAM細胞生存。免疫組化證實PBX1HOXA11HOXD11蛋白存在于LAM肺結節中的ACTA2陽性細胞中(圖2C4F)。磷酸化STAT1(磷酸化STAT1)和磷酸化STAT3定位于LAM肺結節中的細胞核中(圖4G)。 RT-PCR驗證了LAM中幾個PBX-STAT共同靶標基因在細胞死亡的負調節中的表達增加,包括CRYABHAND2(圖4HI)。與單細胞分析和網絡預測一致,作者證明了LAM結節中PBX1HOXA11HOXD11、磷酸化STAT1/3蛋白水平增加,并且預測的PBX-STAT基因靶點(CRYABHAND2)表達增加,從而抑制凋亡。


圖4


6、抑制PBX1會減弱LAM源細胞中STAT1/3的磷酸化

利用慢病毒短發夾RNA(shRNA)621-101細胞中降低PBX1的表達。結果顯示PBX1敲除可將磷酸化Ser727-STAT1水平降低45%和88%,將磷酸化Ser727-STAT3水平降低80%和75%(圖5AB)。細胞周期蛋白D1的蛋白水平,即STAT3的轉錄靶標,不受PBX1減少的影響(圖5A),表明PBX1LAM衍生細胞中不控制cyclin D1依賴的增殖信號。

此外,PBX1敲除減少了LAM衍生細胞中PBX1ESR1的轉錄水平(圖5C)。這些結果表明,在TSC2缺失的LAM細胞中,STAT1STAT3和雌激素受體α(ESR1)的增加表達依賴于PBX1

 

圖5


7、在體外抑制STAT1可促使TSC2缺陷 LAM細胞死亡

LAM患者來源的細胞用氟達拉濱(NSC 118218FaraAFludarabine)處理,該處理可使 STAT1 mRNA 和蛋白質降解。2448小時后,Fludarabine處理顯著提高了TSC2缺陷621-101細胞中 ESR1 的轉錄水平(圖5D)。與 TSC2-expressing 621-103 細胞(GI50 = 852.2 μM)相比,Fludarabine 處理顯著降低了 TSC2缺陷 621-101 細胞的存活率(生長抑制劑濃度50%GI50= 56.1 μM),這一結果在72小時內出現(圖5EF)。然后,作者對621-101621-103 細胞分別使用逐漸增加的濃度的Fludarabine處理72小時。相位對比顯微鏡顯示,55.6500μM Fludarabine處理導致621-101細胞死亡明顯增加,而621-103細胞不受影響(圖5G)。使用水晶紫染色顯示,與 621-103 細胞相比,Fludarabine處理的621-101細胞的染色減少(圖5HI)。與對照組相比,48小時的Fludarabine處理減少了磷酸化STAT1的水平,降低了PBX1的蛋白質水平(圖5J)。去氧氟達拉濱處理后,TSC2缺陷621-101細胞中出現明顯的PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶)裂解(圖5JK及表2),這表明TSC2缺陷細胞發生了凋亡。網絡分析和功能研究共同證明,PBX1STAT 家族轉錄因子協同作用抑制LAM細胞的凋亡并促進細胞存活,這種效應可被STAT信號抑制所逆轉。


8、在活體實驗中,抑制STAT1并未影響Tsc2敲除的大鼠子宮肌瘤來源細胞的肺部定植

為了評估抑制STAT1活化的潛在治療效果,使用Fludarabine處理Tsc2缺陷 ERL4細胞16小時。與對照組相比,Fludarabine100μM)沒有改變Tsc2缺陷 ERL4細胞的熒光素酶活性(圖6A)。免疫印跡分析顯示,Fludarabine處理降低了STAT1STAT3的磷酸化水平(圖6B),這表明在體內抑制了STAT1。接下來,作者測試了FludarabineERL4細胞在肺部殖民化的影響。將ERL4細胞注入雌性NOD scid gammaNSG)小鼠體內。在1小時內,所有小鼠胸部區域的生物熒光強度相似(基線),在細胞接種后6小時,所有小鼠的生物熒光強度略有增加。Fludarabine處理72小時不影響ERL4細胞在肺部的定植(圖6CE)。總的來說,這些數據表明,在體內抑制STAT1活化不足以抑制Tsc2缺陷 ERL4細胞的生存和/或在肺部的定植。


9、抑制HOX-PBX1二聚體化促進TSC2缺陷細胞死亡

為了評估抑制HOX-PBX1二聚化在LAM中的潛在治療效果,使用不斷增加濃度的HXR9Bio-Synthesis Inc.LewisvilleTXUSA)來處理TSC2缺陷 621-101ERL4細胞,這是一種可滲透細胞的合成肽,可以抑制HOX-PBX相互作用。 HXR950μM)殺死了TSC2缺陷 621-101細胞(圖7AB),表明阻止HOX-PBX1二聚化的細胞毒性作用。HXR9處理提高了TSC2缺陷621-101細胞中cleaved caspase-3和受體相互作用蛋白激酶1RIPK1)的磷酸化水平,但在TSC2重新表達的621-103細胞中未觀察到這種效應(圖7C),這表明增強了細胞凋亡和壞死。接下來,作者測試了HXR9ERL4細胞的肺轉移的影響。HXR9預處理成功抑制了細胞接種后2448小時的肺轉移(圖7DE)。將表達熒光素的LAM衍生的621-101-luciferase621L9)細胞轉染兩個獨立PBX1-shRNA的女性C.B-Igh-1b /IcrTac-PrkdcscidSCID)小鼠進行注射(圖7F)。盡管在接種pLKO.1PBX1-shRNA細胞的小鼠中,胸部區域的熒光強度在1小時內相似(基線),但是在接種PBX1-shRNA細胞的小鼠中,在接種后2448小時,熒光強度明顯降低(圖7GH)。


圖6


總之,這些數據表明PBX1-HOX相互作用調節了TSC2缺陷 LAM患者衍生的細胞的存活和肺轉移。

 

 

圖7


參考文獻:

Tasnim Olatoke et al. ,Single-cell multiomic analysis identifies a HOX-PBX gene network regulating the survival of lymphangioleiomyomatosis cells.Sci. Adv.9,eadf8549(2023).DOI:10.1126/sciadv.adf8549