異常剪接通常歸因于剪接因子（SF）突變，并與包括急性髓系白血病（AML）在內的惡性腫瘤有關。發現了一種與突變無關的方法，即真核轉錄起始因子eIF4E，也能廣泛地重編程可變剪接（AS）。本文于2023年2月發表在《EMBO JOURNAL》期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、eIF4E過表達通過其RNA輸出功能影響剪接因子的蛋白水平

作為研究eIF4E在剪接中可能作用的第一步，作者檢查了先前收集的內源性核eIF4E RIP-seq數據集，該數據集來自侵襲性B細胞淋巴瘤LY1細胞系，其中核eIF4E與約3000個轉錄本相關。作者分析顯示，eIF4E與約100個RNA相關，這些RNA編碼參與剪接調節的因子，其中53個RNA編碼主要剪接體的組分，包括SF3B1和U2AF1，這些因子在AML中經常突變。有趣的是，STRING分析揭示所有主要的剪接復合體的顯著富集，根據剪接組的不同，FDR范圍從0.0016到2.19×10^－49不等（圖1A）。這個結果促使作者分析內源性eIF4E是否可以調節剪接因子的產生，從而調節剪接。

為探究潛在的eIF4E剪接軸，作者基于以下幾個原因優先使用U2OS細胞進行研究。首先，與上述淋巴瘤細胞不同，U2OS細胞具有內源性eIF4E水平，這與健康的志愿者細胞相似，使作者能夠測量eIF4E過表達的影響。其次，在細胞核中觀察到內源性和過表達的eIF4E，這與剪接和細胞質中的潛在作用一致（圖1B-H）。第三，eIF4E在這些細胞的capping、CPA、核RNA輸出和翻譯中發揮著公認的cap - dependent作用。最后，淋巴瘤和U2OS細胞之間這些相互作用的保守性表明這是eIF4E的一般功能，而不是淋巴瘤特有的現象。考慮到這些，作者生成了3個穩定的2FLAG-eIF4E過表達或vector對照細胞株。首先確定eIF4E是否調節SFs的水平。WB顯示，在2FLAG-eIF4E細胞中，SF3B1、U2AF1、U2AF2、PRPF6、PRPF8、PRPF19、PRPF31、SNRNP200蛋白水平較Vector對照組升高約2 ~ 3倍（圖1C）。CyclinD1和Mcl1作為陽性對照，而b-actin作為陰性對照，因為它們不是eIF4E的靶標（圖1C）。與過表達相反，使用CRISPR-eIF4E或CRISPR-Ctrl U2OS細胞系檢測結果顯示內源性eIF4E敲低會降低這些SFs的水平（圖1D）。這些發現表明內源性eIF4E影響剪接機制的產生，因此，eIF4E對SFs的影響并不局限于以eIF4E升高為特征的環境。總之，eIF4E依賴的方式可以驅動SFs的產生。eIF4E靶向的SFs存在于每個主要的剪接體復合體中（圖1A和1E）。

接下來探究eIF4E是否通過核輸出的機制影響SFs蛋白的產生。作者從核裂解物中進行eIF4ERIP以確定eIF4E是否與U2OS細胞中SFs編碼的RNA結合。在IP過程中，核裂解物與甲醛交聯以防止重配，并通過RT-qPCR監測RNA。觀察到含有SF3B1，SNRNP200，PRPF6，PRPF8，PRPF31，U2AF1，U2AF2的內源性核eIF4ERIP相比于input，被富集了約2到4倍（圖1F）。鑒于這種相互作用，作者研究了這些SFs編碼RNA是否為eIF4E依賴核輸出的靶標。為此，作者使用上述三種不同的細胞系，通過RT-qPCR檢測2FLAG-eIF4E細胞中相對于Vector對照的細胞核和細胞質部分的RNA水平，發現它們都在eIF4E過表達后胞質/核比率增加了~2倍，表明eIF4E過表達增加了它們的核輸出（圖1G）。分級質控采用半定量PCR檢測U6snRNA和tRNAMet，其分別表示細胞核和細胞質部分（圖1G）。總之，這些發現表明，eIF4E增強SFs編碼RNA核輸出，這為eIF4E介導的SFs蛋白產生的升高提供了一種機制。

除了通過核RNA輸出來驅動SFs的產生外，eIF4E還可能間接驅動轉錄和/或改變SFs編碼RNA的轉錄穩定性，作為驅動其蛋白質產生的平行手段。然而，作者注意到文獻中典型的eIF4E靶點，eIF4E過表達不調節任何RNA的總水平（圖1H）。因此，eIF4E不影響這些SF編碼轉錄本的穩態轉錄或RNA穩定性。

圖1eIF4E通過其核運輸活性改變SF景觀

為分析eIF4E依賴的RNA輸出與其翻譯功能對SF蛋白產生的相對貢獻，作者使用了一個功能分離突變體。eIF4ES53A突變體具有完全結構，結合m7Gcap，促進eIF4E依賴的翻譯和野生型eIF4E；然而，它不能促進依賴eIF4E的核內RNA輸出。作者比較了2FLAG-eIF4E、S53A突變體和Vector對照的SFs蛋白產量。檢測了每個細胞系的3個穩定克隆，并注意到野生型和S53AeIF4E表達水平相似（圖2A）。正如預期的那樣，作為eIF4E-RNA輸出的既定目標，如CCND1，S53A突變體不能刺激細胞cyclinD1蛋白的產生，其水平與Vector對照組相似，而在野生型eIF4E過表達的細胞中，其水平如預期的那樣升高。總之，對于所測試的SFs，S53A突變體沒有像野生型eIF4E那樣促進蛋白表達，這證實了eIF4E在SFs蛋白升高中具有核輸出作用。

為更深入地研究一些SFs在RNA輸出和翻譯水平上共同調控的可能性，作者使用多聚體裝載來直接測量翻譯效率，即每個轉錄本裝載的核糖體數量（圖2B）。如預期的，2FLAG-eIF4E和Vector細胞的整體多核糖體特征是不可區分的（圖2B）。在較重的餾分中發現的轉錄本，每個轉錄本有更多的核糖體，因此比在較輕的餾分中發現的轉錄本翻譯效率更高。用RT-qPCR比較了2FLAG-eIF4E和Vector U2OS細胞系中單體、輕質和重質多核糖體部分的SF編碼RNA含量（圖2B）。預計在翻譯水平上受到影響的RNA在重核糖體部分會增加，同時在輕核糖體和單體部分會減少。發現ACTB mRNAs沒有因為eIF4E的表達而發生改變，而陽性對照MYC和VEGF則如預期的那樣轉移到較重的核糖體中。PRP31、U2AF1、SNRNP200或PRPF6轉錄物的核糖體負荷沒有變化。然而，PRPF8、SF3B1和U2AF2 mRNAs的特點是eIF4E依賴性地轉移到重多核糖體，并在輕核糖體和單體部分減少（圖2B，中間部分）。與S53A突變體觀察到的蛋白水平一致，觀察到這里的大多數eIF4E目標是核輸出目標；然而，少數目標在輸出和翻譯水平上都對eIF4E敏感，使得它們對eIF4E水平更加敏感。

綜上所述，eIF4E與許多SF編碼RNA相互作用并促進其核出口。此外，eIF4E并沒有調節這些轉錄物的穩態轉錄或穩定性。對S53A突變體的研究強烈支持eIF4E的核RNA輸出功能在驅動SF蛋白生產中的主要作用，但對一些SFs來說，也有翻譯的貢獻，使這些后一種RNA對eIF4E失調更加敏感。

圖2分析S53AeIF4E突變體對其改變SF景觀能力的影響及其在翻譯中的作用

2、eIF4E在AML細胞系和原發性AML標本中驅動SFs的產生

為從遺傳學角度剖析eIF4E在AML背景下的作用，并與U2OS進行比較，以確定這些eIF4E機制是否在不同的細胞類型中是保守的，構建了eIF4E或Vector NOMO-1穩定細胞系。NOMO-1 eIF4E細胞產生的eIF4E蛋白水平和定位與高eIF4E AML標本相似（圖3A）。相比于對照組，這些SFs蛋白水平在NOMO-1 eIF4E細胞中上調（圖3A）。而使用eIF4E inhibitor ribavirin的效果則相反（圖3B）。因此，eIF4E對SFs的調控也適用于AML細胞。

接下來，研究原發性AML標本中eIF4E狀態是否與SFs水平相關。如圖3C所示，結果和AML細胞類似，相比于健康或正常組，eIF4E高表達的AML患者組SFs蛋白水平顯著升高（圖3C）。因此，這些SF的升高并不是AML患者標本的普遍特征，而是與eIF4E水平相關，這與在U2OS和NOMO-1細胞中的研究一致。

圖3eIF4E在AML中重編程SF景觀

3、eIF4E在物理上與剪接體相互作用

隨后檢測eIF4E是否與SFs相互作用，為eIF4E可能影響剪接的提供額外手段。在RIPs之前，核裂解物用甲醛交聯，以防止處理過程中的重新組合。觀察到內源性eIF4E與U1、U2、U4、U5和U6snRNAs免疫共沉淀，相比于input，在U2OS細胞（圖1F）以及NOMO-1細胞（圖3D）的核裂解物中富集了約3至10倍。內源性eIF4E與陰性對照（GAPDH和ACTB）無關。此外，在U2OS或NOMO-1細胞中eIF4E過表達后，UsnRNAs的水平沒有改變，這表明eIF4E沒有導致更多剪接體的產生（圖1H和3E）。鑒于UsnRNAs在剪接體中發揮結構和催化作用，作者研究了eIF4E是否與剪接體的蛋白質組分物理相關，結果發現內源性eIF4E與U2OS（圖4A）和NOMO-1細胞（圖4B）中每個主要剪接體復合體的蛋白組分發生免疫沉淀，但不沉淀陰性對照。因此，正如在eIF4E依賴capping和CPA中觀察到的那樣，eIF4E促進SFs的產生可能是為了增加其與它們的蛋白質形式物理相互作用的能力。總之，eIF4E與幾個主要剪接體的SF和UsnRNAs結合，并在AML和U2OS細胞環境中提高了SF蛋白水平。因此，eIF4E被定位為在不同的細胞環境中調節剪接，這表明這可能是eIF4E的一個廣泛適用的特性。

4、eIF4E與剪接體的相互作用是RNA和m⁷Gcap敏感的

如上文所述進行免疫沉淀，只是由于RNAse步驟，U2OS細胞的核裂解物沒有甲醛交聯，然而，即使在沒有交聯的情況下，在未處理的對照組中，SFs和eIF4E之間也觀察到相同的相互作用（圖4A vs 4C）。觀察到SF3B1，U2AF1，U2AF2，PRPF6和PRPF8都存在于未處理的對照中，并且這種相互作用在RNAse處理后減少了約5倍（圖4C）。分離對照表明，作為核標志物的Lamin在這些核裂解物中富集，而MEK1作為細胞質標志物缺乏，此外，在處理或未處理的樣本中，eIF4E均未與Lamin免疫沉淀（圖4C）。因此，eIF4E-SF相互作用需要完整的RNA。

考慮到RNAse處理同時針對底物m7Gcap的pre-mRNAs和UsnRNAs，作者研究了用m7Gcap的類似物處理的影響，這將破壞m7Gcap的mRNA相互作用而不影響UsnRNA介導的相互作用。進行eIF4ERIPs作為m7GpppG或陰性GpppG對照的功能，并通過WB監測SF的關聯（圖4D）。關于RNAse處理，核裂解物沒有甲醛交聯，eIF4E在m7GpppG或GpppG處理的樣品中都能免疫沉淀自身（圖4D）。此外，eIF4E-4EBP1的相互作用沒有受到m7GpppG或GpppG的影響，eIF4E-IP與陰性對照H2B也沒有影響。相對于GpppG對照組，eIF4E與PRPF6、U2AF3和SF3B1之間的相互作用被m7GpppG處理減少了2-5倍（圖4D）；此外，HuR/ ELAVL1-eIF4E復合物在m7GpppG處理下也減少了約5倍（圖4D）。鑒于eIF4E通過m7Gcap相互作用與大多數RNA相關，這些研究表明，eIF4E和SF的相互作用是由底物m7GcapRNA介導和/或穩定的。這些結果表明，eIF4E招募了選定的m7Gcap的RNA到剪接體，并且/或者在那里穩定了它們的相互作用。

圖4eIF4E以RNA和帽依賴的方式與剪接機制發生物理相互作用

5、單獨過表達eIF4E足以改變剪接程序

基于上述發現，作者監測了eIF4E對U2OS細胞整體水平剪接的影響。使用rMATS，觀察到約760個轉錄物的約890個剪接事件被改變（FDR-adjusted P-value < 0.15; inclusion differences of > 0.05 or < 0.05），使用更嚴格的截斷值（Pvalue< 0.1, inclusion level differences of > 0.1 or < 0.1），觀察到493個轉錄物的555個剪接事件（圖5B）。在RNA-Seq實驗中，共檢測到TPM大于10的5738個被注釋的轉錄物，表明約15%的被注釋的轉錄物是以eIF4E-dependent的方式進行差異剪接的。SE是最頻繁的事件（約55%），其次是MXE事件（約30%）（圖5A）。聚類熱圖顯示所有類型的剪接事件僅基于eIF4E水平被分離（圖5B）。GO分析顯示，這些轉錄本參與的GO條目包括細胞周期、膜運輸、DNA修復和微管細胞骨架組織。PPI富集分析與GO一致，排名靠前的是細胞周期，RNA代謝和膜運輸（圖5C）。這些結果表明單獨過表達導致AS景觀改變。

圖5 eIF4E過表達驅動了大規模的剪接重編程

6、在AML中eIF4E水平與差異剪接程序相關

接下來研究了eIF4E依賴性剪接在AML中的相關性，因為在AML中用利ribavirin靶向eIF4E提供了臨床益處，包括在早期臨床試驗中AML患者中的一部分得到緩解。第一步，作者分析了來自437份AML患者樣本和17份來源于人臍帶血的正常CD34+細胞樣本的RNA-Seq數據（圖6A-C）。通過RNA-Seq數據對樣本進行了預篩選，以確保樣本不攜帶AML中報告的主要突變，即U2AF1、SRSF2或SF3B1的突變，使用正常CD34+細胞作為eIF4E水平基準，將AML標本分為高eIF4E組和正常eIF4E組（圖6A-B）。在rMATS分析中，選擇10個eIF4E水平最高的AML標本和11個eIF4E水平正常的標本，即與正常CD34+細胞中的水平重疊或低于其水平（圖6A-C）。相應的臨床數據顯示，與11名eIF4E水平最低的AML患者（1396天，圖6C）相比，10名高eIF4E的AML患者的總生存期急劇下降（中位生存期136天，圖6C）。用rMATS比較這些高eIF4E和正常eIF4E標本的剪接譜，觀察到~1,600個差異剪接事件，影響到~1,500個RNA（FDR-adjusted Pvalue< 0.1, absolute value of inclusion level differences of > 0.1），如果降低閾值（(absolute inclusion value difference of > 0.05 and FDR-adjusted Pvalue< 0.15），則有~12,000個差異剪接事件影響~4,600個轉錄物（圖6D）。對這些AS事件進行無監督聚類分析，發現AML患者eIF4E表達狀態與MXE事件密切相關，在監測MXE事件時，20/21例AML標本的eIF4E水平是聚集的基礎（圖6E）。與U2OS細胞相似，觀察到eIF4E依賴的MXE靶點的前GO富集項與U2OS數據集中的高度相似：細胞周期，DNA修復，膜運輸和RNA代謝，PPI富集于有絲分裂中心體、膜運輸和notch信號通路（圖6F）。U2OS和AML數據集中所有eIF4E依賴的剪接靶點的交集獲得了一組核心的約450個常見RNA靶點（圖7A）。類似的，GO和PPI分析顯示它們也富集到細胞周期，DNA修復，膜運輸，染色質修飾，適應性免疫系統，MYC激活等（圖7B）。

圖6 AML中eIF4E依賴的AS事件

7、eIF4E AS靶向的一個子集與核eIF4E發生物理相互作用

作者使用RT–qPCR驗證了圖7A中核心拼接目標中的幾個eIF4E誘導的可變剪接事件（圖7C）。作者調查了eIF4E是否在剪接體之前（或與剪接體一起）被招募到pre-mRNA上？或者這些eIF4E-轉錄物的聯系是否是剪接產物特異性的。為解決這個問題，使用甲醛交聯進行核eIF4ERIPs并使用特異性引物RT-qPCR分析RNA含量。結果與用底物和產物RNA的引物獲得的RNA的水平進行了比較，后者作為正常化對照。觀察到，eIF4ERIPs與尚未經歷目標剪接事件（"未剪接"）的轉錄本，以及那些已經經歷了剪接事件（"已剪接"）的IL1B、IL4R、IKBKB、FAAP20和MAPK8IP3富集（圖7D）。這些發現表明eIF4E在至少某些剪接靶點的剪接中起直接作用。此外，這些研究首次表明eIF4E與pre-mRNA結合，這對eIF4E的功能具有重要意義。

圖7識別和驗證核心剪接網絡以及與pre-mRNAs AS靶點的物理相互作用

總之，本研究證實，核eIF4E與SF編碼的RNA有物理聯系，并驅動它們的核輸出，這些轉錄物的核輸出增強反過來又增加了它們對翻譯機器的可用性，并提高了SF蛋白的水平，并且eIF4E在整體水平重建了細胞SFs（圖7E）。

參考文獻：

Ghram M, Morris G, Culjkovic-Kraljacic B, Mars JC, Gendron P, Skrabanek L, Revuelta MV, Cerchietti L, Guzman ML, Borden KLB. The eukaryotic translation initiation factor eIF4E reprograms alternative splicing. EMBO J. 2023 Feb 27:e110496. doi: 10.15252/embj.2021110496. Epub ahead of print. PMID: 36843541.